平車前無性系建立的研究

王曉旭，夏鴻飛，李 慧，姜長陽

(遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連 116081)

平車前(Plantago depressa)又名大葉車前、車輪菜、牛舌草等，為車前科車前屬多年生草本植物。平車前為臨床上的常用中藥，全草和種子均可入藥［1］。平車前有清熱、利尿、明目、祛痰等功效，用于治療小便黃少、暑濕泄瀉、尿路感染、目赤澀痛、痰多咳嗽等疾病［2－3］。現代研究證實，平車前除具有以上功效外，還具有止瀉護肝、降壓、抑菌、降低血清膽固醇等多種藥理作用［4］。在臨床上平車前主要用于治療水腫、慢性活動性肝炎、隱匿性腎炎［5］、陰道炎等癥。此外，平車前還可作為野菜食用和畜禽的青飼料。車前屬植物多數分布于受人為干擾強烈的生境中，是理論生態學、生理生態學、進化生物學研究的理想材料［6］。研究者的調查發現，由于平車前具有重要的藥用、食用和飼用價值，多年來的大量采挖和生存環境的破壞，導致近年來野生平車前資源的分布和數量都急劇減少，現在，在大連郊區已經很難采到野生平車前。因此，尋求平車前快速繁殖的方法顯得尤為重要。此前已有許多關于車前植物的研究報道［7－12］，多集中于其藥用價值及成分分析方面，迄今未見平車前無性系建立的報道。本次試驗針對平車前愈傷組織增殖和分化進行研究，篩選出適合平車前無性系建立的最佳條件，進而建立平車前的無性系，有利于平車前的大量繁殖，獲得好的經濟價值及生態意義。

1 材料與方法

1.1 材料與滅菌及培養條件

將采自大連郊區山坡上的平車前植株用清水沖洗干凈后，根和葉柄剪成5 cm左右的段狀，葉片剪成若干5 cm左右的小塊狀后，放到磨口廣口瓶中，用自來水振蕩洗滌10 min，之后用體積分數為0.05%安利洗滌液洗滌約10 min，再用自來水振蕩洗滌3～5次至材料無泡沫。將材料置于超凈工作臺上，用體積分數為70%～75%的乙醇滅菌12s左右后，迅速用無菌水振蕩洗滌3～5次，再加入濃度為0.05%的HgCl2溶液浸泡滅菌14 min，緊接著用無菌水洗滌4～5次即獲得無菌材料。MS培養基中蔗糖含量為30 g·L－1，1/2MS 培養基中蔗糖含量為 15 g·L－1，瓊脂含量為 4.5 g·L－1，pH 5.8 ～6.0，每日持續光照12 h，光照強度為2 000Lx，培養溫度為24℃。

1.2 方法

1.2.1 不同生長素對根、葉片和葉柄愈傷組織誘導的影響

將無菌材料中的根和葉柄剪成長0.5 cm左右的小段，葉片剪成邊長為0.5 cm左右的小塊。剪取材料時，盡可能取幼嫩部位。將以上3種材料分別接種于添加不同生長素的MS培養基上進行愈傷組織的誘導培養，材料先置于暗箱中培養15 d，再置于恒溫光照培養箱中培養30 d。每種培養基每種材料接種培養30個。

1.2.2 不同濃度配比的6－BA和2，4－D對平車前葉柄愈傷組織誘導的影響

將無菌的平車前葉柄剪成0.5 cm左右的小段，接種到附加不同濃度6－BA和2，4－D的MS培養基上進行愈傷組織的誘導培養，每種培養基接種培養40個材料，先置于暗箱中培養15 d，再置于光照培養箱中培養30 d。試驗重復3次。觀察平車前葉柄的出愈情況，45 d后統計結果。

1.2.3 不同濃度6－BA、2，4－D 和 NAA 配比對愈傷組織增殖的影響

將在 MS+6－BA0.2mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L培養基上初代培養的愈傷組織分成0.4～0.5 cm左右的塊狀后，接種在附加不同濃度6－BA、2，4－D和NAA配比的增殖培養基上，置于恒溫光照培養箱中進行平車前愈傷組織的增殖培養。每種培養基接種50個材料，每種處理重復3次。觀察愈傷組織的生長情況，45 d后統計愈傷組織的增殖狀況。

1.2.4 不同濃度6－BA、KT和NAA對愈傷組織分化的影響

以MS為基本培養基、附加不同濃度的6－BA、KT和NAA，設計出12種培養基，將 MS+6－BA0.2 mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖30 g/L這一培養基上繼代培養后顏色嫩綠的愈傷組織接種到各種培養基中，每種培養基接種100個直徑約為0.5cm的愈傷組織團塊，置于恒溫光照培養箱中進行為期45 d的愈傷組織分化培養并統計分化率，此試驗重復2次。把分化培養的平車前不定芽從基部剪下，接種到與顆粒狀愈傷組織分化培養相同的培養基上，進行不定芽的分化繼代培養。

1.2.5 不同生長素對平車前不定芽生根的影響

將上述繼代分化培養的不定芽從基部剪下，接種到以1/2MS為基本培養基，分別附加 IAA 0.2 mg/L、IBA 0.2 mg/L、NAA 0.2 mg/L、2，4 － D 0.2 mg/L 和蔗糖 15 g/L 的培養基上。接種時不定芽植物學下部的生長點插入培養基，于變溫光照條件下進行生根培養。每種培養基接種培養45個材料，試驗重復2次。

1.2.6 煉苗移栽

將培養著生長旺盛，根系發達試管苗的培養瓶打開瓶塞，將試管苗轉移到有水的燒杯中，置于陽光不能直射的實驗臺上，煉苗3d后移栽到上半層分別為干凈河沙、爐灰渣和園土，下半層為肥沃園土的溫室花盆中，移栽試驗重復2次，共移栽300株。

2 結果

2.1 不同生長素對根、葉片和葉柄愈傷組織誘導的影響

外植體接種10 d后，葉片邊緣及葉柄、根兩端切口出現膨大，已形成白色的愈傷組織;暗箱中培養15 d后，轉到光照培養箱中培養，在以2，4－D為生長素的培養基上愈傷組織顏色慢慢轉為嫩黃色(見圖1)。45 d后統計，結果見表1。由表可見以葉柄為外植體愈傷組織誘導率優于葉片和根，葉片的誘導率要高于根。單獨使用2，4－D的誘導效果最好，NAA次之，單獨使用IBA和IAA兩種生長素幾乎不能誘導這三種平車前材料形成愈傷組織。隨著誘導時間的延長，含有NAA的培養基愈傷組織會分化成根。試驗結果表明，葉柄是平車前愈傷組織誘導的最佳外植體，2，4－D是平車前愈傷組織誘導的最佳生長素。

圖1 誘導的平車前愈傷組織Fig.1 The induction of callus

表1 不同生長素對不同材料愈傷組織誘導的影響Tab.1 The effects of different auxin on callus induction of different explants

2.2 不同濃度配比的6－BA和2，4－D對平車前葉柄愈傷組織誘導的影響

由表2可見，接種培養的平車前葉柄在所有培養基中都能誘導形成愈傷組織，每種培養基的誘導率都達到了100%。但從愈傷組織的生長速度和愈傷組織的長勢看，4號培養基誘導形成的愈傷組織生長速度快、長勢好。接種在這種培養基上的葉柄，培養10d左右外植體兩端切口開始出現愈傷組織，隨后愈傷組織開始迅速生長。初期形成的愈傷組織外表光滑、淺黃色的半透明狀，培養到45d變成直徑為0.2cm左右黃綠色顆粒狀。觀察還表明，當2，4－D濃度過高時，抑制愈傷組織生長。6、7號培養基出現水浸狀愈傷組織，可能與其生長素濃度較高有關。因此，MS+6－BA0.2mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L 是愈傷組織誘導的最佳培養基。注:+++為長勢好，++為長勢較好，+為長勢一般。

表2 不同植物生長調節劑配比對葉柄愈傷組織誘導的影響Tab.2 The effects of different hormone combinations on callus induction of stripes

2.3 不同濃度6－BA、2，4－D和NAA配比對愈傷組織增殖的影響

接種10 d后可見愈傷組織開始慢慢增大。由表3可看出，試驗所用的培養基均能夠不同程度的使愈傷組織增殖。觀察結果表明，雖然2，4－D是誘導平車前愈傷組織的最佳生長素，但卻不適合愈傷組織繼代培養。在3號培養基即附加了濃度為0.2 mg/L 6－BA和濃度為2.0 mg/L NAA、基本培養基為MS的培養基上，愈傷組織的增殖速度最快，所培養出的顆粒狀愈傷組織質地疏松，并呈有光澤的嫩綠色(見圖2)，生長速度較快，試驗證明此種愈傷組織具有分化能力。把在3號培養基上培養45d的愈傷組織，在相同培養基上進行繼代培養，連續培養3代，所形成的愈傷組織的外觀仍然保持不變。以上試驗表明，MS+6－BA0.2 mg/L+NAA2.0 mg/L是平車前愈傷組織增殖的理想培養基。

圖2 愈傷組織的增殖培養Fig.2 The proliferation of callus

表3 不同生長調節劑配比對愈傷組織增殖的影響Tab.3 The effects of different hormone combination on callus proliferation

2.4 不同濃度6－BA、KT和NAA對愈傷組織分化的影響

由表4可以看出，在不加激素、只單加6－BA、KT兩種細胞分裂素的培養基中平車前顆粒狀愈傷組織均不能分化，而在不同濃度配比的6－BA和NAA，KT和NAA的培養基中，平車前的顆粒狀愈傷組織會不同程度地分化出根(見圖3)。由此也可以看出，平車前愈傷組織可能含有較多的內源生長素。但添加三種激素的培養基中，愈傷組織分化出了不定芽。在添加6－BA 1.0 mg/L、KT1.0 mg/L和NAA0.5 mg/L的培養基上，分化培養到14d左右時，愈傷組織顆粒即可分化出可見芽點。分化培養到45d時，不僅顆粒狀愈傷組織的分化率達到了87%，每個愈傷組織顆粒還會分化形成為有3～7個不定芽組成的長勢較好叢生不定芽。但在光照不強的情況下，愈傷組織會因為花青素較多而變成紫紅色(見圖4)。把上述分化培養形成的叢生不定芽從基部剪下，接種到相同的培養基上進行不定芽的分化培養。經過3次重復試驗證明，不定芽經過45d培養，平均每個培養的不定芽可分化生長出高5 cm以上的不定芽5.7個。以上試驗表明，MS+6 － BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L是愈傷組織分化的最佳培養基。

圖3 分化出根的愈傷組織Fig.3 Differentiation out of the root of callus

圖4 分化后出現花青素的愈傷組織Fig.4 Anthocyanins in callus

表4 不同濃度6－BA、KT和NAA對愈傷組織分化的影響Tab.4 The effects of different hormone combination on callus differentiation

2.5 不同生長素對平車前不定芽生根的影響

28 d觀察統計，結果見表5。在添加IAA培養基上生根率為100%且試管苗長勢最好。觀察發現，在添加IAA培養基上，不定芽培養至第8 d開始生根，從平均生根數、根長以及苗長勢等方面看，變溫條件下有利于平車前生長芽生根的生長素依次為IAA、NAA、IBA和2，4－ D。因此，IAA是平車前生長芽生根的最佳生長素。

表5 生長芽變溫光照下生根情況Tab.5 The rooting situation of Plantago depressa with poikilothermal illumination

2.6 移栽

移栽后30 d統計證明:移栽的理想基質為園土，移栽成活300株，成活率為100%。

定植后30 d統計證明:定植成活 100株，成活率100%。定植成活的試管苗生長良好，當年開花結果，保持了野生平車前的植物學性狀(見圖5)。

圖5 移栽的試管苗Fig.5 Tube seedlings of transplanting

3 討論

對于愈傷組織的誘導，取材部位［13］，生理狀態及外植體大小都會影響培養結果。在植物的組織培養中用于愈傷組織誘導的外植體一般取自幼嫩部位或新生長的器官組織，如幼嫩的葉片、根、花、莖段、塊根和塊莖等。本次研究發現，葉柄是平車前愈傷組織誘導的最佳外植體，根和葉片不適合愈傷組織誘導。將培養材料置于暗培養條件下，培養7d后取出進行光照培養，這樣操作更有利于愈傷組織的誘導［14］。平車前愈傷組織的誘導也需要進行暗培養，直接進行光照培養會引起外植體的死亡。誘導愈傷組織，2，4－D的生長調節活性最強，NAA次之，IAA和IBA的作用較弱較差［15］。本次研究證明，平車前愈傷組織的誘導的最佳生長素是 2，4 －D。MS+6－BA0.2 mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L是平車前葉柄愈傷組織誘導的最佳培養基，MS+6 －BA0.2 mg/L+NAA2.0 mg/L+蔗糖30 g/L是平車前愈傷組織繼代增殖培養的最佳培養基。在愈傷組織分化培養的過程中，最好是先誘導分化出芽，因為形成芽后在其基部很容易形成根。但愈傷組織先分化形成根則會抑制芽的形成［16］。生長素/細胞分裂素比例決定著芽和根的分化。一般來說，當生長素比細胞分裂素比值高時，有利于根的生長，比值低時有利于芽的生長，中間比值利于愈傷組織的誘導和分化［17－18］。本次研究發現，在不同濃度配比的6－BA和NAA，KT和NAA的培養基中，平車前的顆粒狀愈傷組織會不同程度地分化出根。只有在添加6－BA、NAA和KT三種激素的培養基中，平車前愈傷組織分化出了不定芽，分化的最佳培養基為MS+6－BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L。分化培養的愈傷組織需要充足的光照，在試驗過程中，由于光照不足有的愈傷組織會因為細胞含有較多的花青素而呈現紫紅色。

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