牛奶中慶大霉素半定量膠體金試紙條的研制

北京陸橋技術有限責任公司

王麗哲 王麗麗 趙 瑜于重楠 唐慧林 劉 敏

中國檢驗檢疫科學研究院 何艷玲

慶大霉素屬于常見的氨基糖苷類藥物之一，在獸醫(yī)臨床中應用廣泛，對于奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的治療均有很好的療效（徐亭，2005）。然而，慶大霉素對人類具有明顯的毒害作用，對腦神經(jīng)、聽覺以及腎臟的損害嚴重，隨著該藥的大量使用，其殘留檢測也漸漸被人們所重視 （李桂平等，2008）。我國及歐盟對慶大霉素的殘留有嚴格要求，在牛奶中的最大殘留限量不能高于100 μg/kg。

本研究研發(fā)了一種半定量檢測牛奶中慶大霉素的膠體金試劑盒，在傳統(tǒng)膠體金檢測的基礎上加以改進，包含有一條控制線（C線），兩條不同限量的檢測線T1、T2（均包被目標檢測物全抗原），用于牛奶樣品中目標殘留物的半定量檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 氯金酸 ，SIGMA公司；硝酸纖維素膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊、塑料背襯，均為Millipore公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗儀器 BioJet點膜儀XYZ 3050，BioDot公司；數(shù)控斬切機ZQ5000，上海金標生物技術公司；高速低溫離心機3K15，SIGMA公司；水浴鍋BT-47，YAMATO公司；恒溫培養(yǎng)箱Ic160，Sacvis公司；恒溫磁力攪拌器HJ-3，金壇市科興儀器廠；冰箱FF40，海爾公司；冷藏柜MDF-192AT，SANYO公司；渦旋振蕩器MS1 Minishaker，IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 慶大霉素偶聯(lián)抗原合成 慶大霉素屬于小分子抗原，需要與其他蛋白偶聯(lián)制備成全抗原方具有免疫原性，并需以競爭法制備膠體金試紙條。稱取40 mg慶大霉素硫酸鹽和10 mg BSA，分別溶解于1 mL的蒸餾水中，將BSA溶液逐滴加入到慶大霉素溶液中，室溫下于磁力攪拌器上攪拌2 h以上。取120 mg EDC.HCl溶于1 mL蒸餾水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室溫下繼續(xù)攪拌1 h以上，然后于4℃放置過夜。用PBS透析3 d后，分裝，-20 ℃貯存（徐亭，2005）。

1.3.2 抗體-膠體金標記

1.3.2.1 膠體金溶液的制備 將1 g氯金酸溶于超純水配制0.01%的氯化金水溶液，取100 mL加熱至沸騰，在攪動狀態(tài)下加入1.5 mL的1%檸檬酸三鈉水溶液。繼續(xù)加熱煮沸15 min，隨后冷卻至室溫，用超純水恢復至原體積，在波長510～550 nm測定其最大吸收波長，并4℃避光保存（付云潔等，2010；鄧省亮等，2007）。

1.3.2.2 最適標記pH的確定 取15個1.5 mL試管，分別加入1 mL制備好的膠體金溶液，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié) pH 為 3、4、5、6、7、8、9、10，后室溫放置10 min；加入濃度為0.2 mg/mL的慶大霉素抗體，每管各60 μL，混合后室溫放置30 min；觀察膠體金顏色變化，直到室溫下放置2 h仍保持紅色的為最適pH。

1.3.2.3 最低標記蛋白量的確定 取6個1.5 mL試管，分別加入1 mL制備好的膠體金溶液；用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH為最適pH，混合后室溫放置 10 min； 分別加入 10、15、20、25、30、35 μL、0.2 mg/mL慶大霉素抗體，混合后室溫放置30 min；每管加入20 μL濃度為10%的NaCl溶液，混合后室溫放置10 min；顏色仍保持紅色的最小蛋白用量即為最小蛋白標記量。

1.3.2.4 抗體-膠體金復合物制備 取已制備好的膠體金溶液50 mL，用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)pH至最適標記pH。攪拌中加入抗體至最適標記蛋白量，繼續(xù)攪拌20 min，加入10%BSA水溶液直至BSA的終濃度為1%，繼續(xù)攪拌10 min；于4℃、12000 r/min離心30 min，小心棄去上清，加入 50 mL 0.01 mol/L Tris-HCl溶液 （pH 8.2，含1%BSA，簡稱TBS）再重復清洗一次，最后用5 mL 0.01 mol/L TBS將沉淀重懸，0.22 μm微孔濾膜過濾，4℃避光保存。

1.4 免疫層析膠體金試紙條的制備 方法參照許定花等（2009）中的制備方法。

1.4.1 檢測線、控制線及抗體-膠體金復合物包被濃度的確定 包被T1、T2兩條不同濃度的慶大霉素偶聯(lián)抗原在硝酸纖維素膜上，作為層析試紙條的檢測線；包被二抗（兔抗鼠抗體）在硝酸纖維素膜上作為層析試紙條的控制線，其中控制線包被在兩條檢測線上方；再包被抗體-膠體金復合物在膠體金結合墊上作為游離反應物，通過對添加慶大霉素標準品的檢測結果分析，調(diào)整兩條檢測線的包被濃度，以及抗體-膠體金復合物的包被濃度，使T1、T2兩條檢測線在檢測牛奶樣品中慶大霉素時，最終靈敏度分別為20 μg/kg和100 μg/kg。

1.4.2 膠體金試紙條各組分的組裝 依次將包被有T1、T2線和C線的硝酸纖維素膜、膠體金結合墊、樣品墊和吸水墊貼到背襯上，組裝成大卡；然后將大卡用斬切機切割成4 mm寬度的試紙條，用于后續(xù)實驗。

2 結果和分析

2.1 膠體金溶液的制備 所制備的膠體金顏色為紅色，透明，在510～550 nm其最大吸收值為1.149，對應的吸收波長為528 nm（圖1）。

圖1 膠體金溶液最大吸收波長掃描圖

2.2 最適pH的確定 經(jīng)過實驗確定的最適標記pH為8。

2.3 最低標記蛋白量的確定 經(jīng)過實驗確定的最小蛋白用量為 25 μL，即 5 μg/mL。

2.4 免疫層析膠體金試紙條的制備 最終確定抗體-膠體金復合物用TBS以 1∶1比例稀釋后濃度最合適，將此溶液包被玻璃纖維，37℃恒溫干燥箱烘干用于制備免疫層析試紙條。確定的控制線包被濃度為0.3 mg/mL，兩條檢測線T1、T2包被濃度分別為0.1 mg/mL和0.5 mg/mL。

用組裝的免疫膠體金試紙條檢測牛奶樣品，T1、T2兩條檢測線的靈敏度可分別達到20 μg/kg和100 μg/kg（圖2）。且樣品僅需稀釋即可上樣檢測，5 min內(nèi)即可出結果，方法簡便，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。

圖2 陰性牛奶樣品添加慶大霉素標準品 20 μg/kg 和 100 μg/kg 檢測結果

3 討論與小結

目前牛奶中慶大霉素的殘留檢測常用的方法是液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和免疫膠體金層析法。前兩種方法需要專業(yè)人員和設備，無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，傳統(tǒng)的免疫膠體金層析法可以實現(xiàn)樣品的現(xiàn)場操作，但只能實現(xiàn)樣品殘留的定性檢測，而無法做到半定量檢測（馬偉等，2009；齊雪琴，2006）。

本實驗通過牛奶樣品中的目標殘留物與呈橫條狀分布于免疫層析膜上的 T1、T2線共同競爭性地與膠體金標記抗體反應，由免疫層析膜上T1、T2線的顯色情況來判定待檢樣品中目標殘留物的含量范圍，當層析膜上的T1、T2均顯色時，說明待檢測樣品中的殘留物含量低于最低檢測限；當層析膜上T1、T2線只有一條顯色，說明待檢測樣品中殘留物的含量在最低檢測限和最高檢測限之間；當層析膜上T1、T2線均不顯色，僅有C線顯色時，說明待檢測樣品中殘留物的含量超過了最高檢測限。該慶大霉素半定量金標快速檢測試劑盒，最低檢測限為20 μg/kg，最高檢測限為100 μg/kg。設定的最低檢測限可以滿足企業(yè)對于優(yōu)質(zhì)奶源分級篩選的要求，最高檢測限可以滿足我國以及歐盟標準最高殘留限量要求。

由此可見，本研究所制備的免疫層析試紙條在檢測牛奶樣品時，檢測方法簡單，所需檢測時間短，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，不僅實現(xiàn)了對樣品的定性檢測，更能對樣品進行半定量檢測，對奶制品質(zhì)量控制方面來說有重大意義。

[1]鄧省亮，賴衛(wèi)華，許楊.膠體金免疫層析法快速檢測黃曲霉毒素B1的研究[J].食品科學，2007，28（2）：232 ～ 236.

[2]付云潔，劉志國，武玉香，等.膠體金免疫層析法快速檢測食品中金霉素殘留[J].食品科學，2010，31（2）：191 ～ 194.

[3]李桂平，張海棠，王自良，等.慶大霉素的毒副作用及其殘留檢測[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2008，47（6）：723 ～ 725.

[4]馬偉，汪寶歡，李娟，等.慶大霉素酶聯(lián)免疫檢測法研究[J].食品科學，2009，30（10）：242 ～ 244.

[5]齊雪琴.電化學液相色譜分析慶大霉素的方法 [J].福建分析測試，2006，15（1）：4 ～ 7.

[6]徐亭.慶大霉素單克隆抗體的制備及初步應用：[碩士學位論文][D].揚州：揚州大學，2005.

[7]許定花，劉麗強，鄭蓓蓓，等.膠體金免疫層析法參數(shù)的優(yōu)化[J].食品科學，2009，30（20）：155 ～ 159.