加減銀翹散提取工藝的優化

遼 寧 醫 學 院 蔣 紅 王宏軍＊ 禹 嫙

中牧實業股份有限公司 李新國

天津市寶坻區人民醫院 武新亮

加減銀翹散，以金銀花、連翹為君藥，甘草為佐使藥，引入天花粉為臣藥，符合中獸醫藥理論，該組方被本課題組命名為銀翹天甘，并已開展了該方的藥理活性研究、藥物劑量配比研究、活性成分研究及含藥血清制備工藝的研究 （耿鳴禹等，2012；王宏軍等，2011；鄒宇等，2009；王宏軍等，2009）。為提高銀翹天甘制劑的浸出率，采用L9（34）正交試驗設計，以乙醇濃度、提取時間、提取次數、提取方法為影響因素，以浸膏率及抗菌活性作為評定指標優化其最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞源性大腸桿菌（CMCC44102），由中國獸藥監察所提供；豬鏈球菌，由遼寧醫學院獸醫微生物實驗室提供。

1.1.2 中草藥 金銀花、連翹、天花粉、甘草購自易達中藥飲片有限公司（批號：20080425），經鑒定為正品。

1.1.3 試劑 營養瓊脂 （杭州微生物試劑有限公司，批號：20070226）；營養肉湯（北京奧博星生物技術責任有限公司，批號：20050103，20070226）；無支原體新生牛血清 （杭州天杭生物科技有限公司，批號：101115）；按照成品培養基說明調配而成，121℃高壓滅菌20 min后，瓊脂培養基制成平板，4℃冰箱保存備用。

1.1.4 主要儀器 YH-350Z型全自動不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器，上海三申醫療器械有限公司；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；隔水式恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；QE-200 g型粉碎機，武義縣屹立工具有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；索氏提取器，天津市北辰區光明玻璃儀器廠；RE-5203型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-ⅢB型循環水真空泵，浙江臨海市精工真空設備廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組方設計 將金銀花、連翹、天花粉、甘草4味藥按比例組方（王宏軍等，2011），粉碎，過60目篩，稱取若干份，以乙醇濃度、提取次數、提取時間、提取方法作為考察因素，每個因素設3個水平（表 1），進行 L9（34）正交試驗。

表1 試驗因素與水平

1.2.2 中草藥提取 按表1設計的因素水平和表2安排的提取工藝條件提取銀翹天甘制劑，減壓濃縮，60℃干燥至恒重，每組重復3次，按下式計算浸膏率。

1.2.3 血清培養基的制備 液體培養基冷卻后，配制成含10%血清的液體培養基；固體培養基溫度降到55℃左右時加入血清，配制成含10%血清的培養基，混勻后澆平板，4℃冰箱保存備用。

1.2.4 試驗菌懸液的制備 取菌種0.5 mL放入10 mL適宜的液體培養基中混勻，37℃恒溫培養18～24 h為原菌液。采用活菌計數方法推算原菌液中細菌的個數（陳奇，1992）。用滅菌生理鹽水將菌液稀釋到105CFU/mL即為供試菌液。

1.2.5 最小抑菌濃度的測定 用微管-平板法測定最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.6 抗菌活性綜合評分 采用抗菌活性綜合評分（Z）方法，評價不同工藝制備的銀翹天甘制劑對雞大腸桿菌、豬鏈球菌活性的綜合效應，按下式計算：

式中，X為銀翹天甘制劑對雞大腸桿菌的MIC；Y為銀翹天甘制劑對豬鏈球菌的MIC；i為試驗序號1～9；max為MIC的最大值。

1.2.7 驗證試驗 以浸膏率和抗菌活性為響應值，將獲得最優工藝按照相應方法進行驗證試驗，重復6組，以確定銀翹天甘制劑的最優提取工藝。

1.2.8 統計分析 正交試驗采用極差分析法，驗證試驗采用t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 浸膏率 由表2可見，極差結果顯示，4個因素的顯著順序為：D＞B＞A＞C，最優提取工藝為：A3B3C3D3。

2.2 抗菌活性 分別對9個工藝獲得的銀翹天甘制劑進行抗雞大腸桿菌和豬鏈球菌抗菌活性的測定，銀翹天甘制劑對雞大腸桿菌和豬鏈球菌的MIC均在0.125～0.5 g/mL。由表2可見，由抗菌活性綜合評分作為響應值，4個因素的顯著順序為：C＞D＞B＞A，因抗菌活性是MIC值越小表明活性越高（陳奇，1992），故以抗菌活性為響應值時，最優提取工藝為：A3B2C2D3或A2B2C2D3。

表2 L9（34）正交試驗設計及結果

2.3 驗證試驗 分別以浸膏率和抗菌活性綜合評分得到3個較優提取工藝（表3）。由表3可見，工藝2浸膏率達到最大值60.61%，與工藝1和工藝3均差異極顯著 （P＜0.01）；對雞大腸桿菌的MIC為0.125 g/mL，對豬鏈球菌的MIC為0.177 g/mL，與工藝3差異顯著（P＜0.05）。

表3 銀翹天甘提取工藝驗證試驗結果

3 討論

3.1 中草藥復方提取工藝的設計 大量研究表明，絕大多數中草藥復方提取工藝的試驗研究采用正交試驗設計的方法（陳堅平和王思鴻，2008），也有的采用均勻設計法（趙瑞芝等，2006），正交試驗設計方法應用最為廣泛，簡單易行，不但節約了大量的時間而且也節省了大量的材料。由表2和表3可知，超聲波+索氏提取法能夠提高銀翹天甘制劑的浸膏率，再配合70%乙醇，浸膏率明顯升高；而從抗菌活性方面來看，該方法的影響相對要小很多。

3.2 優選提取工藝的評定方法 提取工藝的評定方法，常用的是測定某一成分的含量來進行評定，如浸膏重（劉春海等，2006）。陳堅平和王思鴻（2008）用正交試驗法優選復方當歸苦參片的提取工藝研究中以提取液中阿魏酸的含量以及總固體得率的綜合評定為評價指標。在銀翹天甘提取工藝篩選中，認為中草藥復方制劑的浸膏率是未來工業生產重要關注點，至于活性成分，也是需要考慮的，但作為一個中草藥復方發揮作用的成分可能不只一種，那么只檢測某一種成分的含量不足以說明問題，所以檢測指標引入了藥理活性，金銀花、連翹、甘草均具有抗菌活性，此外，該組方的創制也是以抗細菌感染為主，故采用浸膏率與抗菌活性作為響應值進行綜合評定，為該制劑開發成抗菌口服液奠定基礎。

通過正交試驗得出中草藥復方銀翹天甘的提取工藝為A3B2C2D3即乙醇濃度為70%，提取2次，每次提取1 h，提取方法為超聲波與索氏提取相結合，浸膏率可達到60.61%，對雞大腸桿菌的MIC為0.125 g/mL，對豬鏈球菌的MIC為0.177 g/mL。

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[9]鄒宇，王春華，蔣紅，等.銀翹天甘防治雞大腸桿菌病的體外抑菌試驗[J].畜牧獸醫科技信息，2009，4：42 ～ 43.