青霉α-半乳糖苷酶基因工程菌表達條件優化

北京市營養源研究所 張 波 蕭培珍 張寶彤＊

α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22）主要催化半乳糖類寡糖和多聚半乳-（葡）苷露聚糖非還原性末端α-1，6鍵結合的半乳糖苷化合物水解，因此其能水解棉子糖、水蘇糖和毛蕊糖等低聚糖。自然界微生物分泌表達α-半乳糖苷酶活性很低，生產成本較高，難以適應工業化生產的要求。為提高青霉α-半乳糖苷酶（α-Gal）的活力，本實驗室構建了青霉α-半乳糖苷酶基因工程菌pPIC9k-9菌株。影響外源蛋白表達的因素較多，其中培養基組成、培養溫度、搖床轉速、發酵液pH、誘導物的濃度、誘導時機、種子接種量以及誘導濕菌重等均會影響外源蛋白的表達。本試驗研究了基因工程菌高效表達的影響因素，為下一步的研究和生產提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器 恒溫圓周搖床 （IKA KS4000i型，上海人和科學儀器有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司）。

1.1.2 試驗菌株和培養基 青霉α-半乳糖苷酶重組菌株為本實驗室保存。

低鹽LB液體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，水溶解后，用NaOH調pH至7.0，加水定容至1 L。高壓蒸汽滅菌20 min，4℃儲存備用。

緩沖型甘油復合培養基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀溶液 （pH 6.0），1.34%酵母基礎氮源培養基，1%甘油，4×10-5%生物素。

緩沖型甲醇復合培養基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀溶液 （pH 6.0），1.34%酵母基礎氮源培養基，0.5%甲醇，4×10-5%生物素。

1.1.3 主要試劑 酵母提取物、酵母基礎氮源培養基及胰蛋白胨均購自OXOID公司，pNPG購自Sigma公司，其他試劑均購自國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養 用無菌牙簽挑取適量菌種接種于滅菌的LB液態培養基，28℃搖床培養。當細胞培養至OD600為3.0時，收集菌體轉移至裝載30 mL緩沖型甘油復合培養基的100 mL三角瓶，28℃搖床培養。當細胞培養至OD600為3.0時，收集菌體轉移至裝載150 mL緩沖型甲醇復合培養基的1 L三角瓶中，測定細胞OD600為3時，用一定濃度的甲醇進行誘導表達，誘導72 h取發酵液于12000 r/min離心，取上清液測定其酶活性。

1.2.2 發酵參數的優化 搖瓶水平發酵條件的優化采用4因素3水平L9（34）正交試驗，共9個處理，每個處理3個重復。試驗因素與水平見表1。

表1 因素與水平

1.2.3 酶活的測定 酶活的測定方法參考Rezessy-Szabó等（2007）的方法。 底物配制：用0.05 mol/L的乙酸鈉（pH 5.2）充分溶解對硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷 （pNPG）至終濃度為10 mmol/L。

反應過程：0.5 mL底物和0.5 mL適當稀釋的酶液（用pH 5.2，0.05 mol/L的乙酸鈉稀釋）分別在40℃水浴保溫3 min，然后充分混和均勻，于40℃水浴反應10 min，加入4 mL的0.5 mol/L的乙酸鈉終止反應。產生的黃色對硝基酚于405 nm處進行吸光度測定。

酶活單位定義：在40℃、pH 5.2的條件下，每分鐘從濃度為10 mmol/L的pNPG溶液中降解釋放1 μmol的對硝基酚所需要的酶量為1個酶活單位（U）。

2 結果與討論

基因工程產品通過表達優化，可以為發酵生產提供良好的工藝條件，降低成本，提高經濟效益，提高產品的競爭力（顧娟等，2010）。pH可影響底物分子和酶分子的帶電狀況，從而影響微生物對營養物質的吸收利用和酶的活力，這可能是發酵培養基的初始pH影響酵母細胞生長和產酶的原因。種子接種量也是影響蛋白表達的一個因素，接種量的多少直接影響細胞生長的速度，因此對于表達蛋白有直接或間接的影響。轉速對酵母細胞生長和產酶的影響可能是由于酵母細胞屬于需氧微生物，搖床轉速直接影響發酵培養基中溶解氧的水平（Petzelbauer等，1999）。本試驗將重組菌株pPIC9k-9在1 L搖瓶培養，誘導72 h，取其上清液測定相應的酶活，正交試驗結果見表2。由表2可見，培養基pH對發酵產物的影響最大，其次是搖床轉速，主次因素排列順序為：培養基pH ＞搖床轉速＞種子接種量＞甲醇濃度。當培養基pH為5，搖床轉速為200 r/min，種子接種量為5%，甲醇濃度為1.0%時，發酵上清液酶活性最高。

表2 正交試驗結果

3 小結

本試驗結果表明，容量為1 L的三角瓶裝載150 mL培養基，培養基pH對基因工程菌分泌青霉α-半乳糖苷酶酶活影響最大，其次是搖床轉速，主次因素排列順序為培養基pH＞搖床轉速＞種子接種量＞甲醇濃度。

[1]顧娟，勞勛，金飛明，等.人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白在大腸桿菌中的自誘導表達純化[J].微生物學通報，2010，37（5）：726 ～ 731.

[2]Petzelbauer I，Nidetzky B，Haltrich D，et al.Development of an ultrahigh-temperature process for the enzymatic hydrolysis of lactose I.The properties of two thermostable β-glycosidases[J].Biotechnol Bioeng，1999，64（3）：322～332.

[3]Rezessy-Szabó J M，Nguyen Q D，HoschkeAˊ，et al.A novel thermostable α-galactosidase from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus CBS 395.62/b：Purification and characterization[J].Biochim Biophys Acta，2007，1770：55～62.