接枝微粒PGMA/SiO2的制備及其功能化轉變＊

雷青娟，高保嬌，張正國，姜桂明

(中北大學 化學工程系，山西 太原 030051)

酶的固定化是近幾十年來生物技術領域中最為矚目的進展之一。這一技術既克服了游離酶催化過程中酶催化劑與底物及產物難以分離的缺點，又可使酶催化劑重復利用，極大地提高了酶催化的效率與穩定性［1～3］，因此關于酶的固定化一直是生物界與化學界廣泛關注的課題。

含有環氧基團的載體，其表面的環氧基團與蛋白質大分子鏈上的多種基團(氨基、巰基、酚羥基等)均很容易發生反應，無需任何鏈接分子即可與生物大分子形成穩定的共價鍵。因此，無論是實驗室的研究還是工業規模的實際應用，含有環氧基團的聚合物微球都是共價結合法固酶的較為理想的載體［4，5］。甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)是含有環氧基團的單體，通過均聚或共聚制備的交聯聚合物微球，經常被用作酶固定化載體［6～8］。

雖然環氧載體是固酶的一種良好載體，但在一般條件下實施酶的固定化時。由于環氧基團的反應活性不夠高［9，10］，得不到高的固酶效率。研究者們在載體表面引入對酶蛋白具有親和作用的第二功能基團，形成雙功能載體，以提高固酶效率。

本文以偶氮二異丁腈(AIBN)為引發劑，γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)為偶聯劑，采用“接出”法將甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)接枝于微米級硅膠(SiO2)微粒表面制得接枝微粒PGMA/SiO2(1);以乙二胺(EDA)為功能單體，對1進行改性，在EDA表面引入胺基制得雙功能復合載體EDA-PGMA/SiO2(2，Scheme 1)。對接枝聚合的影響因素進行了系統地研究，并初步考察了2對辣根過氧化物酶(HRP)的固定性能。結果表明，2能顯著地提高HRP的固定化效率，對于采用共價偶聯法實現酶的高效固定化具有一定的參考價值。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1700型傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片);Zetasizer Nano-Z型Zeta電位分析儀;721型分光光度計。

硅膠(120目～160目)，試劑級，青島海洋化工有限公司;MPS，分析純，南京曙光化工集團有限公司;GMA，分析純，蘇州南航化工有限公司，用前減壓蒸餾提純;AIBN，分析純，天津市大茂化學試劑廠;EDA，分析純，天津市化學試劑三廠;辣根過氧化物酶(HRP，250 U·mg-1，等電點在pH 8.0附近)，生化試劑，上海雪滿生物技術有限公司;其余所用試劑均為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 制備

(1)1制備

將硅膠30 g置于5%甲烷磺酸溶液中，攪拌下于90℃活化8 h。抽濾，濾餅用蒸餾水洗滌，真空干燥制得活化硅膠(A)。

在50%乙醇100 mL中加入A 10 g和單體MPS 10 mL，攪拌下于50℃反應24 h。抽濾，濾餅用乙醇洗滌，真空干燥得經KH-570表面改性的硅膠微粒MPS/SiO2。

在四口燒瓶中加入 MPS/SiO21.5 g，DMF 100 mL和單體GMA 5 mL，通氮氣30 min以排除體系中的空氣。升溫至70℃，加入引發劑AIBN(w=1.4 wt%，占單體GMA的質量分數，下同)，攪拌下于70℃接枝聚合反應20 h。抽濾，濾餅置索氏抽提器中，用丙酮抽提24 h以除去物理吸附在微粒表面的聚合物。取出，真空干燥制得白色固體1，采用鹽酸-丙酮法［11］測定1表面上的PGMA的接枝度(GD)。

(2)2的制備

在四口燒瓶中加入1 2 g和DMSO 40 mL，浸泡溶脹12 h。加蒸餾水40 mL，用20%NaOH溶液調至pH 11.0;加入 EDA 40 mL，攪拌下于80℃反應一定時間。過濾，濾餅用蒸餾水反復洗滌除去未反應的EDA，經真空干燥得白色固體2。

采用重量法按下式計算接枝PGMA環氧基團的開環反應轉化率，即EDA的鍵合率(BR)。

式中:m1(g)為1的質量，m2(g)為2的質量;M'(60.1)為n(2)-n(1);GD(g·100 g-1)為1的接枝度;M(142.15)為接枝PGMA的鏈節摩爾質量

1.3 2對HRP的固定化性能測定

在錐形瓶中加入2 0.5 g和0.1 g·L-1HRP(pH 8.5)10 mL，于25℃恒溫振蕩一定時間進行酶的固定化制得固定化酶。以偶聯率(CR)表示2對HRP的固定化效果。HRP的活力采用沃辛通法［12］測定，利用所測得的原酶溶液活力(E0/U·mL-1·min-1)與固定化后殘余酶活力(Ef/U·mL-1·min-1)數據計算HRP的CR［CR=(E0-Ef)/E0×100%］。

用電位分析儀在不同pH條件下測定2的ζ電位，繪制ζ電位曲線。

2 結果與討論

2.1 表征

1和2的IR譜圖見圖1。由圖1可見，在1的IR譜圖中顯示出接枝聚合物PGMA的特征吸收(酯羰基的伸縮振動吸收峰位于1 732 cm-1處，環氧鍵的特征振動吸收峰位于905 cm-1處)。從2的IR譜可見，1 567 cm-1附近出現了伯氨基鍵(C-N)的吸收峰，同時，在905 cm-1處環氧鍵的特征振動基本消失。譜峰的變化充分表明，通過接枝PGMA大分子鏈中環氧鍵的開環反應，EDA已經鍵合在接枝微粒1上，形成了雙復合載體2。需要說明的是，受SiO2強吸收背景的影響，兩種微粒的諸特征吸收都顯得很弱。

圖1 1和2的IR譜圖Figure 1 IR spectra of 1 and 2

2.2 接枝聚合的影響因素

采用接枝度為指標來考察諸因素對接枝聚合的影響。于70℃反應20 h，其余反應條件同1.2(2)，考察諸因素對接枝聚合的影響，以尋找最佳的聚合條件。

(1)引發劑用量［w(AIBN)］對接枝度的影響

改變引發劑用量，其余反應條件同1.2(1)，考察w(AIBN)對接枝度的影響，結果見圖2。從圖2中可看到，隨著w(AIBN)的增加，接枝度呈現先增大后減小的變化規律，w(AIBN)=1.4 wt%時，具有最大的接枝度(17.48 g·100 g-1)。這是因為引發劑用量過大時，接枝聚合反應的速率過快，且接枝聚合物的分子量低，在短時間內形成致密的阻隔層，阻止接枝聚合繼續進行，故使接枝度降低。最佳的w(AIBN)=1.4 wt%。

圖2 w(AIBN)對接枝度的影響*Figure 2 Effect of w(AIBN)on grafting degree

(2)單體用量［V(GMA)］對接枝度的影響

w(AIBN)=1.4 wt%，其余反應條件同 1.2(1)，改變單體(GMA)用量，考察其對接枝聚合的影響，結果見圖3。從圖3可以看到，PGMA的接枝度隨單體用量的增大而增加，但GMA達11 mL后，接枝度幾乎不再變化(最大為23.55 g·100 g-1)。這是因為隨著單體用量的增大，接枝聚合反應的速率會顯著加快，且有利于生成高分子量的接枝聚合物，接枝率會明顯增大;當單體用量增大到一定值時，接枝率達最大值，再增大單體量，由于接枝聚合反應的速率過快，在較短時間內硅膠表面就會迅速形成致密的聚合物覆蓋層，抑制了接枝聚合反應進行。最佳GMA用量為11 mL。

圖3 GMA用量對接枝率的影響*Figure 3 Effect of GMA amount on grafting degree

綜上所述，接枝聚合的最佳反應條件為:w(AIBN)=1.4 wt%，GMA為11 mL，于70℃反應20 h，1 的接枝度為 23.55 g·100 g-1。

2.3 RDA的鍵合率的變化

圖4為EDA的鍵合率隨時間的變化曲線。從圖4中可看出，在開始階段，EDA的鍵合率隨反應時間而迅速增大;當反應進行到約8 h后，EDA的鍵合率的增大開始趨于緩慢;再延長反應時間，EDA的鍵合率甚至不再改變。其原因在于:當1表面的 EDA鍵合量足夠高時，以鍵合EDA的端伯胺基為反應基團，接枝大分子鏈之間的交聯反應(環氧基團的開環)將逐漸變為主導反應，而EDA的鍵合反應則受到抑制，導致EDA的鍵合量趨于一定值。本研究將反應時間控制在0～8 h，制得EDA的鍵合率在7%～60%內變化的載體微粒2。

圖4 EDA鍵合率隨時間的變化曲線*Figure 4 Variation curve of bonding rate of EDA with reaction time

2.4 表面電性能

圖5為1和2的ζ電位隨介質pH的變化曲線，即它們的ζ電位曲線。從圖5可清楚地看到，在較大的pH范圍內，1的ζ電位幾乎為零(稍顯負值)，即微粒表面不帶電荷;在較大的pH范圍內，2的ζ電位卻為絕對值較大的正值，意味著表面帶有高密度的正電荷。這是由于鍵合在其表面的EDA的胺基，在水介質中會發生質子化作用，使微粒表面帶上了正電荷。

圖5 1和2的ζ電位曲線Figure 5 Zeta potential curves of 1 and 2

2.5 2固定HRP的特性

在pH 8.5的條件下，使用EDA鍵合率不同的功能載體2對HRP進行了固定化，制得了多種固定化酶，即得不同偶聯率的2。圖6給出了HRP在不同載體上的偶聯率隨時間的變化曲線。從圖6中可以清楚地看到:對于EDA鍵合率不同的載體，在4 h內，HRP的偶聯率均達到最高值，表明4 h為適宜的固定化時間。在pH 8.5的條件下實施HRP的固定化時，HRP的偶聯率隨載體表面EDA鍵合率的不同而產生差別;當乙二胺鍵合率較低時，HRP的偶聯率隨載體表面EDA鍵合率增大而提高;當 EDA鍵合率為31.08%(即在30%附近)時，HRP的偶聯率具有最高值(57.85%);當EDA鍵合率繼續增大時，偶聯率轉而下降。

圖6 EDA鍵合不同載體時固定化酶的偶聯率隨時間的變化曲線*Figure 6 Variation curves of HRP coupling rate with time as using carriers with different EDA bonding rates

采用共價偶聯法實現酶的固定化，一般要經歷物理吸附與化學鍵合兩個過程。本研究所用的HRP，其等電點為 8.0，故在 pH 8.5 的條件下HRP蛋白分子帶有負電荷，而功能載體2表面帶有正電荷(圖5)。顯然，兩者之間會產生強烈的靜電相互作用;而且，2表面EFDA鍵合率越高，質子化的胺基密度越高，兩者之間的靜電相互作用越強;因此，EDA鍵合率高的載體將會將大量的HRP蛋白分子吸附致其表面，進而發生化學鍵合，充分發揮雙功能作用，導致高的酶偶聯率。至于當EDA鍵合率超過30%后偶聯率與比活力又呈現下降的趨勢，其原因可能是:EDA鍵合率過高時，由于環氧基團的過多消耗，使表面存留的環氧基團減少，影響了酶蛋白的化學鍵合，使固定化酶的偶聯率。

3 結論

(1)采用“接出”法，將GMA接枝在微米級硅膠微粒表面制備了接枝微粒PGMA/SiO2，乙二胺與接枝PGMA的環氧基團發生開環反應，將乙二胺基團引入接枝微粒表面，形成了雙功能復合載體EDA-PGMA/SiO2。

(2)采用共價偶聯法實施了辣根過氧化酶的固定化，復合載體EDA-PGMA/SiO2結合了硅膠微粒優良的物理化學性能，是固定化辣根過氧化酶的良好載體。更重要的是該復合載體與辣根過氧化酶蛋白之間的靜電相互作用，對酶的固定化可產生顯著的促進作用，有效提高固定化酶的偶聯率。

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