大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)與鑒定

周 薇，海亞萍

（平?jīng)鲠t(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，甘肅 平?jīng)?744000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來(lái)源于中胚層，是具有自我更新及多向分化潛能的成體干細(xì)胞之一。在體外不同誘導(dǎo)條件下，可跨胚層向中胚層細(xì)胞如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等分化[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs還可以分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞等[2]。MSCs易取材、免疫原性低、供體無(wú)明顯并發(fā)癥等特點(diǎn)，使其成為細(xì)胞治療、基因治療及組織器官再造的理想材料[3，4]。MSCs存在于人和動(dòng)物的多種組織中，骨髓中的MSCs最易分離獲得，但含量極低，約為 0.001%～0.010%[4，5]，因此，MSCs體外分離純化、培養(yǎng)、擴(kuò)增至足夠數(shù)量是實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用的前提。本實(shí)驗(yàn)旨在探索MSCs體外分離純化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定的方法，以獲得大量、高純度、高活性的MSCs，為MSCs的系列研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)3周齡Wistar大鼠（甘肅省中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不限，體重 100～150g。

1.2 主要試劑

DMEM/F12（美國(guó)GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（Sigma公司），Percoll分離液（Pharmacia公司），轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、胰島素、氫化可的松、牛血清白蛋白、纖粘連蛋白、低分子肝素、青霉素、鏈霉素（Sigma公司），噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜 （DMSO，GIBCO 公司），CD29mAb-FITC、CD44mAb-FITC、CD34mAb-PE（BD公司）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱（SANYO-IWCD-175型），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD），F(xiàn)ACSAria型流式細(xì)胞儀（BD公司），倒置相差熒光顯微鏡（尼康公司）

1.4 方法

1.4.1 原代大鼠骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)和傳代 將大鼠頸椎脫臼處死，浸泡于75%的酒精中15～20min，無(wú)菌條件下分離股骨、脛骨，PBS沖洗，去除骨兩端，用DMEM/F12反復(fù)沖洗骨髓腔，經(jīng)1ml注射器吸制成單細(xì)胞懸液，按1∶1比例將其加入到Percoll分離液中（1.083g/ml），以 2000r/min 離心 20min，吸取中間霧狀的單細(xì)胞層，并用DMEM/F12洗滌兩次，1000r/min離心20min，其中一部分加入有血清組培養(yǎng)基中，另外一部分加入無(wú)血清組培養(yǎng)基中，按照3×104個(gè)/毫升的密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、飽和濕度、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，3d后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞，以后每2～3d換液一次，待細(xì)胞融合達(dá)70%以上，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，按1∶2的比例傳代。倒置相差熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)。

有血清組培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、氫化可的松（10-6mol/L）、青霉素（100U/ml）及鏈霉素（80mg/ml）的 DMEM/F12培養(yǎng)基。無(wú)血清組培養(yǎng)基為含轉(zhuǎn)鐵蛋白（100μg/ml）、亞硒酸鈉（10mg/ml）、胰島素（10μg/ml）、牛血清白蛋白（1mg/ml）、纖粘連蛋白（40ng/ml）、氫化可的松（10-6mol/L）、青霉素（100U/ml）及鏈霉素（100mg/ml）的 DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.4.2 MSCs增殖水平的檢測(cè)及生長(zhǎng)曲線的繪制 采用MTT法，分別對(duì)兩組培養(yǎng)、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第一、二、三代細(xì)胞，以5×103/孔的密度分別接種于96孔板中。有血清組每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基200μl，無(wú)血清組每孔加入自制培養(yǎng)基200μl。每組設(shè)5個(gè)平行組，置37℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。兩組每3d換液一次。此后每天同一時(shí)間，兩組分別隨機(jī)拿出一板加入 MTT溶液（5mg/ml）20μl，繼續(xù)在 37℃ 、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150μl DMSO。將96孔板放置在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上震蕩20min，用雙波長(zhǎng)測(cè)定法，酶聯(lián)免疫測(cè)定監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)492nm，參比波長(zhǎng)630nm，測(cè)定OD值。取5孔OD值的均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以無(wú)血清組OD均值和空白對(duì)照孔OD均值的差值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.3 MSCs表面C D分子監(jiān)測(cè) 收集第三代MSCs，用胰酶消化細(xì)胞，制成懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/毫升。分別取100μl細(xì)胞懸液，加入兩組樣品管和對(duì)照管，兩組樣品管中分別加入FITC標(biāo)記的兔抗大鼠CD34、CD45、CD44、CD29抗體（1∶100稀釋），對(duì)照管中加入同型對(duì)照抗體，4℃避光孵育30min后，加入2ml細(xì)胞染色緩沖液（PBS+1%FBS+0.1%NaN3，0.22mm濾器過(guò)濾），混勻1000r/min離心5min，棄上清液，加入0.5ml細(xì)胞染色緩沖液重選細(xì)胞，流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)、分析。

1.4.4 MSCs細(xì)胞周期的測(cè)定 參照CycleTest試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別取兩組細(xì)胞的第三代MSCs，胰酶消化，PBS漂洗2～3次后，70%酒精4℃ 固定24h，取100μl細(xì)胞懸液，加入PI染料1ml，4℃避光孵育30min，流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 原代MSCs的分離和培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中分離的原代MSCs體外培養(yǎng)48h后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，原來(lái)單個(gè)散在的細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，多呈圓形、橢圓形，部分呈梭形，貼壁生長(zhǎng)。72h后換液去掉漂浮細(xì)胞見(jiàn)少數(shù)貼壁細(xì)胞開(kāi)始分裂增殖，部分區(qū)域形成細(xì)胞團(tuán)簇，細(xì)胞為紡錘形，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞樣外觀。7d后首次全量換液，貼壁細(xì)胞大部分呈梭形，柵欄樣分布，細(xì)胞數(shù)目增多，融合度為70%。無(wú)血清組第4～5d出現(xiàn)較多貼壁細(xì)胞，9～10d有明顯的細(xì)胞叢生長(zhǎng)，18～20d細(xì)胞融合成片（見(jiàn)圖 1中 A、C）；有血清組第 2～3d出現(xiàn)較多貼壁細(xì)胞，7～8d有明顯的細(xì)胞叢生長(zhǎng)，14d細(xì)胞融合成片（見(jiàn)圖 1中B、D）。

圖1 大鼠MSCs的原代培養(yǎng)

2.2 MSCs生長(zhǎng)曲線的繪制

采用MTT法分別測(cè)定兩組的第三代MSCs。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示：兩組細(xì)胞的增值能力相似，生長(zhǎng)曲線均呈“S”形。有血清組細(xì)胞經(jīng)過(guò)3d左右的滯留期后，進(jìn)入細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到第7～8d細(xì)胞逐漸融合，到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期；無(wú)血清組細(xì)胞經(jīng)過(guò)5d左右，進(jìn)入細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第10d細(xì)胞逐漸融合，到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期（見(jiàn)圖2）。

圖2 MSCs細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.3 流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)MSCs表面C D分子表型

選取兩組第三代MSCs，F(xiàn)ITC間接標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示：兩組的大鼠MSCs均表達(dá)CD29、CD54，不表達(dá)CD34、CD45（見(jiàn)圖3）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組細(xì)胞之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 MSCs表面CD分子表型

2.4 MSCs細(xì)胞周期檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀分別監(jiān)測(cè)分析G0/G1期、G2/M期細(xì)胞百分比，有血清組平均值分別為46.4%、10.9%，無(wú)血清組分別為68.0%、9.2%（見(jiàn)表1、圖4、圖 5），兩組比較差異有顯著性（P＜0.05）。

表1 兩組細(xì)胞周期分析比較（%）

圖5 無(wú)血清組細(xì)胞周期分析結(jié)果

3 討論

MSCs是一種來(lái)自中胚層發(fā)育的早期干細(xì)胞，不僅有多向分化和支持造血功能，還有免疫抑制和誘導(dǎo)免疫耐受的作用，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也可能密切相關(guān)。在整個(gè)生命過(guò)程中，組織器官無(wú)論是處于穩(wěn)定狀態(tài)還是環(huán)境改變時(shí)，都需要這些骨髓來(lái)源的MSCs不斷補(bǔ)充、更新，因此，具有廣闊的應(yīng)用前景。

從骨髓中分離MSCs的方法主要有貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠法4種。后兩種對(duì)細(xì)胞的活性影響較大，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞完全失去活性。本實(shí)驗(yàn)采用Percoll密度梯度離心法和貼壁法相結(jié)合分離純化MSCs，依據(jù)比重差別，用比重1.083的Percoll淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓MSCs，經(jīng)梯度離心后，能有效地將絕大部分紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板去除，獲取純度較高的單個(gè)細(xì)胞，再根據(jù)造血細(xì)胞和MSCs的貼壁性能差異，經(jīng)體外貼壁培養(yǎng)，獲得純度較高的MSCs。

大部分研究者在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)仍采用有血清培養(yǎng)基。血清的主要作用在于給細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子、激素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但血清價(jià)格昂貴，容易被支原體、病毒等微生物感染，此外血清中大量復(fù)雜的成分對(duì)細(xì)胞的分離純化有很大影響。鑒于上述不利因素，從20世紀(jì)50年代開(kāi)始，細(xì)胞生物學(xué)家為研究血清單個(gè)成分在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用，尋找合適的補(bǔ)充因子，以替代血清。Hayashi和Papeleu.P分別利用添加細(xì)胞因子的無(wú)血清培養(yǎng)基均培養(yǎng)出目的細(xì)胞[6，7]。

本研究采用添加細(xì)胞因子的無(wú)血清培養(yǎng)基。添加的因子中，亞硒酸鈉能消除氧化物酶和氧自由基對(duì)細(xì)胞的傷害；受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白/Fe3+復(fù)合物結(jié)合是細(xì)胞獲取必要微量元素（鐵）的主要來(lái)源；白蛋白可以和很多物質(zhì)，如維生素、激素、生長(zhǎng)因子等結(jié)合從而穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)的活性，并有調(diào)節(jié)滲透壓，避免細(xì)胞受機(jī)械損傷等作用；胰島素可以促進(jìn)RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸合成，抑制細(xì)胞凋亡，是重要的細(xì)胞存活因子；纖粘連蛋白是細(xì)胞的貼壁因子。本研究用此種無(wú)血清培養(yǎng)基成功培養(yǎng)出大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)，該培養(yǎng)基所有添加的物質(zhì)及劑量均已知，有助于今后進(jìn)一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的調(diào)控，提高實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)性。此外，流式細(xì)胞儀檢測(cè)無(wú)血清培養(yǎng)下的細(xì)胞68.0%處于細(xì)胞周期的G0/G1期，而有血清培養(yǎng)下的細(xì)胞46.4%處于細(xì)胞周期的G0/G1期，說(shuō)明無(wú)血清培養(yǎng)的條件能較好地保持細(xì)胞處于G0/G1期，使其保持更好的分化潛能，較好地保持其干細(xì)胞特性。

綜上所述，本研究找到MSCs體外分離純化、培養(yǎng)、鑒定的方法，為MSCs的系列研究奠定了基礎(chǔ)。

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