維拉帕米對肝星狀細胞凋亡和Bax表達的影響＊

任美萍 劉明華 李蓉 李萬平△

1.瀘州醫學院藥物與功能性食品研究中心，四川 瀘州 646000；2.瀘州醫學院藥理學教研室，四川 瀘州 646000）

肝纖維化是所有慢性肝病進展成肝硬化的共同病理基礎與必經階段。肝纖維化的主要特征是肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）的增殖及細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）的過度沉積［1］。而HSCs又是產生ECM 最重要的細胞，肝臟遇到致病因子侵襲時，靜息的HSCs被激活分化為肌成纖維樣HSCs，分泌膠原和多種細胞因子，引起肝ECM 合成增加，降解減少，造成肝內ECM 不斷積聚，最后導致肝纖維化甚至肝硬化［2-3］。抑制HSCs的增殖和誘導其凋亡是治療慢性肝損傷和肝纖維化的重要策略。有研究顯示維拉帕米和丹參或尼群地平聯合使用，可預防CCl4／乙醇對大鼠肝功能的損傷，降低肝纖維化程度［4-5］，但維拉帕米對體外培養的HSCs的作用報道甚少。本研究初步觀察了維拉帕米對體外培養的HSCs增殖、凋亡以及凋亡相關蛋白Bax表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

肝星狀細胞株HSCs引自瀘州醫學院附屬醫院傳染與免疫實驗室，采用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基pH 7.2～7.4的完全培養基，在37℃、5%CO2條件下常規培養。

1.1.2 藥品與試劑

鹽酸維拉帕米片：規格：每片40mg，天津市中央藥業有限公司，批號： 090101；DMEM 高糖培養基：賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司，批號：NUB0146；胰蛋白酶：美國Sigma公司；胎牛血清：天津灝洋生物制品科技責任有限公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑盒：碧云天生物技術研究所；4%多聚甲醛固定液：博士德生物工程有限公司，批號：20 081106；AnnexinV-FITC 試劑 盒：Beckman coulter公 司；SABC 試劑 盒 和DAB顯色劑由武漢博士德公司提供；蘇木精染液、伊紅染液、二甲苯等由瀘州醫學院附屬醫院病理科提供。

1.1.3 儀器

酶標分析儀：北京普朗新技術有限公司，型號：DNM-9602；流式細胞儀：BECKMAN COULTER 公司；倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司，型號：CKX41；CO2培養箱：日本Sanyo公司，型號：MCO-15A。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測維拉帕米對肝星狀細胞增殖的抑制作用

取對數生長期的HSCs細胞，調整為適當濃度后接種于96孔培養板，每孔90μL，37℃、5%CO2培養箱常規培養24h貼壁后加藥。維拉帕米采用DMEM 培養基稀釋至所需濃度后加入96孔板，每孔10μL，使其終濃度分別為0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mol·L-1，每個濃度均設4個復孔，陰性對照為等體積培養基。繼續培養48h后每孔加入CCK8 10μL 培養1 h，酶標儀450nm 波長下檢測各孔吸光度A 值，按下列公式計算抑制率，細胞增殖抑制率=［1-（A給藥組-A空白孔）／（A陰性對照組-A空白孔）］×100%。LOGIT 法計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.2 HE染色觀察細胞形態變化

取對數生長期的細胞，0.25%胰酶制成單細胞懸液，細胞濃度為1×108· L-1，每孔450μL 加入鋪有蓋玻片的24 孔板，培養24h待其貼壁。每孔加藥50μL，維拉帕米終濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mol· L-1，陰性組加等體積培養基，繼續培養48h，常規HE 染色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察細胞形態、超微結構變化。

1.2.3 流式細胞儀Annexin V-FITC／PI雙染法檢測細胞凋亡率

將終濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mol·L-1的維拉帕米作用后的HSCs細胞收集于離心管，經預冷的PBS洗滌一次后將細胞懸浮于100μL 的4℃PBS中，每管加Annexin V-FITC 5μL、PI 2.5μL，輕輕震蕩混勻，置冰上避光染色10min，每管加400μL 1×Buffer，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 免疫組化SABC法檢測Bax表達的影響

取對數生長期的HSCs細胞制成密度為5×107· L-1的細胞懸液，每孔450μL加入預先鋪有蓋玻片的24孔板，37℃、5%CO2培養24h待其貼壁。每孔加藥50μL，維拉帕米終濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mol· L-1，陰性組加等體積培養基，繼續培養48h，4%多聚甲醛固定后，采用SABC 法行免疫組化染色，中性樹膠封片，晾干。顯微鏡下觀察，每組隨機采取8個視野拍照，結果用Image-Pro plus6.0圖像分析軟件進行分析，檢測其陽性物質的平均光密度。

1.3 統計學處理

結果以均數±標準差（）表示，采用SPSS13.0統計軟件行單因素方差分析（組間比較用SNK 法），以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8檢測維拉帕米對肝星狀細胞增殖的抑制作用

維拉帕米可抑制HSCs的增殖，隨濃度的增加，抑制作用增強，其IC50值為0.15±0.01 mol· L-1。濃度-抑制率曲線，見圖1。

圖1 維拉帕米對肝星狀細胞增殖的濃度抑制率曲線（n＝4）

2.2 HE染色觀察細胞形態變化

HE染色可見維拉帕米組出現不同程度的細胞體積變小，胞漿減少，核固縮呈藍黑色，細胞貼壁差等改變，而陰性對照組細胞大小均一，胞漿豐富均勻，細胞核規則，核內染色均一呈淡藍色，貼壁良好。

2.3 流式細胞儀Annexin V-FITC／PI雙染法檢測細胞凋亡率

0.02 ～0.10mol·L-1的維拉帕米均可誘導HSCs細胞的凋亡，凋亡率分別為（7.41±0.95）%、（10.06±0.62）%、（13.38±0.61）%、（17.98±0.65）%、（25.11%±1.33）%，呈現出一定的劑量依賴關系，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 維拉帕米誘導HSCs細胞的凋亡率（，n＝3）

表1 維拉帕米誘導HSCs細胞的凋亡率（，n＝3）

注：與陰性對照組比較，aP＜0.05。

2.4 免疫組化SABC法檢測Bax表達的影響

不同濃度的維拉帕米作用48h后HSCs細胞Bax的表達不同程度增強，平均光密度值增加，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

HSCs活化是肝纖維化形成的關鍵，而增殖是HSCs活化的重要特征之一。因此，抑制HSCs的增殖、誘導其凋亡是防治肝纖維化的策略之一［6］。細胞凋亡是組織細胞在正常發育過程中或在病理條件下的一種主動死亡形式，受細胞內基因的精確調控。Bax為促進細胞凋亡基因，在細胞凋亡中發揮重要的調節作用［7］。Bax可直接結合到線粒體膜上，改變膜的通透性，引起細胞色素C釋放入胞漿，激活Caspases家族，最終引起凋亡［8］。

表2 維拉帕米對HSCs細胞Bax表達免疫組化染色平均光密度（，n＝8）

表2 維拉帕米對HSCs細胞Bax表達免疫組化染色平均光密度（，n＝8）

注：與陰性對照組比較，aP＜0.05。

細胞內Ca2+是胞內重要的第二信使，在細胞的功能活動中起著重要的作用。維拉帕米是L型鈣通道阻滯劑，能減少細胞外Ca2+的內流。HSCs細胞上存在L型鈣通道，維拉帕米通過降低細胞內Ca2+，引起細胞內鈣平衡紊亂，本實驗結果顯示維拉帕米可抑制 HSCs 的增殖，且呈劑量依賴性。0.02～0.10mol·L-1的維拉帕米均可誘導HSCs 細胞的凋亡，且藥物濃度增加，凋亡率增加，其機制可能是增強Bax的表達而誘導凋亡。維拉帕米可抑HSCs的增殖，誘導其凋亡，有利于肝纖維化的逆轉。Ca2+的變化可能是誘導HSCs凋亡的關鍵信號，但凋亡的發生是否也有其他信號系統的參與，維拉帕米影響Bax表達的確切機制等相關問題均有待進一步深入研究。

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2 諶輝，劉文琪.姜黃素對日本血吸蟲病小鼠肝纖維化的影響［J］.中國醫院藥學雜志，2008，28（119）：1679-1682.

3 楊悅杰，黃芬.肝星狀細胞及相關細胞因子在肝纖維化形成中的作用［J］.世界華人消化雜志，2007，15（27）：2885-2890.

4 郭晏同，趙景明，宋磊，等.羅格列酮抑制體外大鼠肝星狀細胞活化［J］.基礎醫學與臨床，2008，28（11）：1129-1133.

5 王青山，李亮成.維拉帕米和尼群地平對大鼠肝硬化的實驗研究［J］.山西醫科大學學報，2002，33（4）：307-308.

6 李霞，李亮成.丹參與維拉帕米對大鼠肝纖維化？肝硬化防治作用的實驗研究［J］.山西醫科大學學報，2003，34（1）：18-21.

7 胡泰洪，黃利華，楊玲，等.NHE-1與肝星狀細胞增殖的關系及姜黃色對其的影響［J］.世界華人消化雜志，2009，17（18）：1860-1863.

8 Paradiso A，Simone G，Lena MD，et al.Expression of apoptosis-related markers and clinical outcome in patients with advanced colorectal cancer［J］.？Br J Cancer，2001，84（5）：651-658.

9 Lucken-Ardjomande S，Martinou JC.Regulation of Bcl-2proteins and of the permeability of the outer mitochondrial membrane［J］.C R Biol，2005，328（7）：616-631.