微波輔助提取枳殼中柚皮苷、新橙皮苷的工藝研究

劉學(xué)仁， 蔡品品， 姜 濤， 向顯智， 呂鑒泉*

(1.湖北省黃岡市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，湖北 黃岡 438000;2.湖北師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北黃石 435002)

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種干燥未成熟果實(shí)。枳殼性微寒，味苦、辛、酸、溫，入脾、胃經(jīng)。具有理氣寬中，行氣消滯等功能;用于胸肋氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停，胃下垂，脫肛，子宮脫垂等癥。枳殼中化學(xué)成分主要有黃酮類、揮發(fā)油及少量生物堿等，其中黃酮類成分中又以柚皮苷 (Naringin)和新橙皮苷 (Neohesperidin)等成分，是枳殼理氣、行滯、祛痰和平喘的主要藥理成分。柚皮苷和新橙皮苷具有廣泛的生物活性和藥理作用，能調(diào)節(jié)和干預(yù)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等系統(tǒng)的生理功能和病理變化，也具有抗腫瘤、抗基因突變、抗菌和微生物、抗炎和抗過敏等作用;可以通過競(jìng)爭性抑制來提高其他藥物的生物利用度，等等［1］。

目前對(duì)枳殼黃酮類成分提取和分離方法研究，主要有水浴回流提取法［2］、醇或堿液提酸沉法［3］、索氏提取法［4］、超聲輔助提取法［5］和超臨界流體萃取法［6］等方法。這些提取和分離方法也各有優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在或耗能、耗時(shí)、耗溶劑，或產(chǎn)率不高，或設(shè)備要求高等缺點(diǎn)。采取微波輻射進(jìn)行提取分離，可以克服上述缺點(diǎn)，同時(shí)具有效率高、選擇性強(qiáng)、節(jié)省時(shí)間、節(jié)省溶劑、節(jié)能、污染小等優(yōu)點(diǎn)，目前已應(yīng)用到包括黃酮在內(nèi)的幾大類天然化合物的提取與分離［7-8］。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，采取在常壓條件下用微波萃取枳殼中的柚皮苷和新橙皮苷，考察溶劑、微波萃取功率、提取時(shí)間、溫度等因素對(duì)枳殼中柚皮苷、新橙皮苷提取效果的影響，找出最佳提取工藝條件，為枳殼中黃酮成分的提取分離提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

DIONEX型高效液相色譜儀 (Dionex戴安儀器公司)，包括P680高壓泵、PDA—100檢測(cè)器、TCC—100柱溫箱、ASI—100自動(dòng)進(jìn)樣器。XH—100A微波催化合成/萃取儀(北京市祥鵠科技發(fā)展有限公司);SartoriusCP225D十萬分之一電子分析天平;AB104—N型電子分析天平。

對(duì)照品柚皮苷 (中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110722-200620，純度100%)、新橙皮苷 (西安旭煌技術(shù)有限公司，批號(hào)N-100302，純度98%)。液相用乙腈、甲醇均為色譜純，提取用甲醇為分析純，水為超純水。

枳殼樣品購于安徽亳州藥材專業(yè)市場(chǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 Dikma C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);乙腈-水 (20∶80)(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3)為流動(dòng)相;進(jìn)樣體積20 μL;檢測(cè)波長283 nm;柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別精密稱取減壓干燥至恒定質(zhì)量的柚皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品各3.0 mg，置25.00 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得分別含柚皮苷和新橙皮苷120 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時(shí)，精密取5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10.00 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得分別含柚皮苷和新橙皮苷60 μg/mL工作溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取枳殼樣品粗粉0.2 g，置于100 mL三頸燒瓶中，精密加入相應(yīng)的溶劑50.00 mL，密塞，稱定質(zhì)量。將三頸燒瓶放入微波爐腔室中，接好裝置，接通冷凝水，設(shè)置各參數(shù)，開啟微波。萃取完成后，取出三頸燒瓶放置至室溫，稱定質(zhì)量，用相應(yīng)的溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5.00 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 分別取1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL柚皮苷和新橙皮苷的工作溶液注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行色譜分析。以進(jìn)樣質(zhì)量對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，作出校正曲線。柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=28.217X－0.381 7(r=0.997 8，n=5)，線性范圍為0.062 8×10－6～1.256×10－6g;新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=32.922X－0.269 0， (r=0.999 4，n=5)，線性范圍為0.072 4×10－6～1.448 0×10－6g。見圖1。

圖1 枳殼 (A)、新橙皮苷 (B)、柚皮苷 (C)HPLC色譜圖

2.2.2 精密度試驗(yàn) 分別吸取柚皮苷和新橙皮苷的工作溶液各20 μL，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，柚皮苷的RSD值為0.8%(n=6);新橙皮苷的RSD值為0.9%(n=6)。結(jié)果表明，此方法精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱樣品粗粉0.1 g共6份，按2.1.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品，按上述色譜條件，每份分別進(jìn)樣2次進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定該枳殼樣品中含柚皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.32%，RSD值為1.1%(n=6);含新橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.48%，RSD值為1.3%(n=6)。表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密取枳殼樣品0.152 8 g，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別吸取同一供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，分別在0、1、6、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)定峰面積，柚皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.27%，RSD值為0.9% (n=6);新橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.33%，RSD值為0.5%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定 (含柚皮苷和新橙皮苷分別約為4.32%和2.48%)的枳殼樣品粗粉約0.1 g共6份，在每一份中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品柚皮苷約4.8 mg和新橙皮苷約2.5 mg，按2.1.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品，按上述色譜條件，分別取20 μL進(jìn)樣，照樣品測(cè)定項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定該枳殼樣品中加樣回收率柚皮苷為92.7%，RSD值為2.0%(n=6);新橙皮苷為88.7%，RSD值為2.3%(n=6)。表明本方法準(zhǔn)確度較好。

表1 加樣回收試驗(yàn) (n=6)

2.3 樣品的測(cè)定

2.3.1 萃取條件的正交優(yōu)化 選取溶劑、微波萃取儀功率、提取時(shí)間和提取溫度為考察因素，以測(cè)得的柚皮苷和新橙皮苷量為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)L9(34)，選取最佳提取工藝參數(shù)。因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平L9(34)

2.3.2 測(cè)定結(jié)果與分析 正交實(shí)驗(yàn)9個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)，共取枳殼樣品18個(gè)，每個(gè)樣品取枳殼粗粉約0.2 g，以3個(gè)樣品為一組，按2.1.3項(xiàng)供試品溶液的制備和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的相應(yīng)條件分別進(jìn)行處理、測(cè)定每組柚皮苷和新橙皮苷的量的平均值。測(cè)定結(jié)果及結(jié)果分析見表3。

由表3可知各實(shí)驗(yàn)因素及其因素水平對(duì)枳殼中柚皮苷和新橙皮苷的提取量大小的影響表現(xiàn)出一定的差異。無論是對(duì)柚皮苷還是新橙皮苷的提取，4因素的極差R值的大小排序基本為A＞B＞D＞C;而且4個(gè)因素中，溶劑因素的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他3個(gè)因素的影響。提取的優(yōu)化條件為:80%乙醇作溶劑，微波萃取儀功率400 W，時(shí)間10 min，溫度40℃，即A2B2C2D2。同時(shí)就極差R大小來看，各實(shí)驗(yàn)因素及其因素水平對(duì)柚皮苷的提取影響比對(duì)新橙皮苷的影響更大。分析其可能的原因，一是可能柚皮苷和新橙皮苷在微波作用下熱穩(wěn)定性不同;另一個(gè)可能的原因是兩者的溶解度有一定的差異。

用方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，考察其顯著性，分析結(jié)果見表4。

以柚皮苷為考察對(duì)象，誤差為最小的離差平方和0.54，自由度為2+2=4，F(xiàn)0.05(2，4)=6.94。由表6可知，F(xiàn)A=7.69＞F0.05(2，4)=6.94，所用溶劑為顯著影響因素;F0.05(2，4)=6.94＞FB=1.24＞FD=1.15＞FC=1.00，微波萃取儀功率、萃取時(shí)間、萃取溫度均為不顯著因素。以新橙皮苷為考察對(duì)象，由表4可知，誤差為最小的離差平方和0.08，自由度為 2+2=4，F(xiàn)0.05(2，4)=6.94;FA=9.50＞F0.05(2，4)=6.94;F0.05(2，4)=6.94 ＞FB=1.62 ＞FD=1.50＞FC=1.00，也得到所用溶劑為顯著影響因素，微波萃取儀功率、萃取時(shí)間、萃取溫度均為不顯著因素。從方差的觀點(diǎn)來看，無論是對(duì)柚皮苷還是對(duì)新橙皮苷，微波輔助提取的優(yōu)化條件均為A2B2C2D2，即80%乙醇作溶劑，微波萃取儀功率400 W，時(shí)間10 min，溫度40℃;只是各因素對(duì)柚皮苷和新橙皮苷影響的程度有一定的差別。分析其原因可以得到與直觀分析一致的結(jié)論。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果分析

表4 方差分析

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助提取的方法，對(duì)枳殼中柚皮苷和新橙皮苷提取條件進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是對(duì)柚皮苷還是新橙皮苷，微波提取的優(yōu)化工藝條件是:80%乙醇作溶劑，微波萃取儀功率400 W，提取時(shí)間10 min，提取溫度40℃。與回流提取法的2 h相比，提取時(shí)間大大縮短，效率有了明顯的提高。與索氏提取、超聲輔助提取等方法比，也降低了提取溫度，保證了黃酮成分熱穩(wěn)定性的要求;同時(shí)優(yōu)選80%乙醇作提取溶劑，可以降低其他有機(jī)溶劑殘留毒性。與文獻(xiàn)比較［9］，所獲得的優(yōu)化工藝條件有的參數(shù)是相同的，也有些參數(shù)有一定的差別，這是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)置的因素和水平不同所致。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察枳殼中成分量比較高的兩種成分，更能反映優(yōu)化工藝條件的意義。此方法簡便、準(zhǔn)確、可靠、快速、實(shí)用，對(duì)正確評(píng)價(jià)枳殼中黃酮成分的內(nèi)在品質(zhì)以及蕓香科其他天然藥物中功能性成分的提取、分離及分析方法的建立具有一定的參考與借鑒作用。

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