HPLC-DAD法同時測定附子中5種水溶性成分

唐小龍， 黃志芳， 陳 燕， 劉玉紅， 劉云華， 趙軍寧， 易進海*

(1.成都中醫藥大學，四川成都 610072;2.四川省中醫藥科學院，四川成都 610041)

附子為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品，為有毒中藥的代表，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效［1］。附子中水溶性成分量微、不易檢測，其主要成分有去甲豬毛菜堿 (salsolinol)、去甲烏藥堿 (demethylcoclanrinhihenamine)、棍掌堿 (coryneine)、氯化甲基多巴胺 (coryneine chloride)、尿嘧啶 (uracil)等，均具有強心作用，其中，氯化甲基多巴胺和去甲豬毛菜堿還具有升壓作用［2－6］。但目前尚未見文獻報道附子水溶性成分的定量測定，本實驗首次建立了HPLC-DAD法同時測定附子中鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿嘧啶、尿苷、鳥苷，該方法準確、快速，為附子質量控制提供新的參考方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀系列 (美國安捷倫科技公司，包括四元泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動進樣器，工作站);KQ－100超聲波清洗儀 (昆山市超聲儀器有限公司);AUW220D型十萬分之一電子天平 (日本島津);Sigma3K15高速冷凍離心機 (德國Sigma);Millipore Milli-Q Integral 3超純水機 (美國密理博)。甲醇為美國Fisher色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。

對照品尿嘧啶 (批號:100469-200401)、鹽酸多巴胺 (批號:100070-200405)、尿苷 (批號:887-200202)購自中國藥品生物制品檢定所;鳥苷(批號:10111132)購自上海同田生物技術有限公司;去甲豬毛菜堿對照品由本實驗室從附子中分得，其純度為98.2%，經理化性質和光譜數據分析，鑒定其結構。

生附子采自四川江油等地，其他實驗樣品購于成都荷花池藥材市場，由四川省中醫藥科學院舒光明研究員鑒定為毛莨科多年生草本植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的子根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna 5u PFP(2)100R色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脫 (0～30 min，100∶0→87∶13);體積流量1.0 mL/min;檢測波長為260 nm(尿嘧啶，尿苷，鳥苷)和280 nm(鹽酸多巴胺，去甲豬毛菜堿);柱溫35℃;進樣量10～50 μL;對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖1。

圖1 對照品 (A)和附子藥材 (B)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.2 對照品溶液的制備 取尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷、鳥苷對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含尿嘧啶0.022 mg、鹽酸多巴胺0.026 mg、去甲豬毛菜堿 0.026 mg、尿苷0.055 mg、鳥苷0.037 mg的混合對照品溶液Ⅰ。精密吸取上述混合對照品溶液1 mL，加水溶液稀釋至10 mL，搖勻，即得混合對照品溶液Ⅱ。

2.3 供試品溶液的制備 取附子粉末 (過三號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L鹽酸25 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用0.05 mol/L鹽酸補足減失的質量，搖勻，高速離心 (12 000 r/min)5 min，取上清液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系 精密吸取2.2項下混合對照品溶液Ⅰ5、10、15、20 μL和混合對照品溶液Ⅱ2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀中，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到尿嘧啶的回歸方程Y=5.13×103X+2.62，r=0.999 9;鹽酸多巴胺的回歸方程Y=8.58×102X－9.21，r=0.999 9;去甲豬毛菜堿的回歸方程Y=8.52×102X－9.07，r=0.999 9;尿苷的回歸方程Y=2.62×103X+4.24，r=0.999 9;鳥苷的回歸方程Y=2.68×103X+6.01，r=0.999 9。結果表明，尿嘧啶，鹽酸多巴胺，去甲豬毛菜堿，尿苷和鳥苷進樣量分別在 0.004 4～0.44 μg，0.005 2 ～0.52 μg，0.005 2 ～ 0.52 μg，0.010 9 ～1.09 μg和0.007 3 ～0.73 μg范圍內線性關系良好。

2.4.2 檢測限與定量限 在選定的色譜條件下，當信噪比為3時，測得尿嘧啶的檢測限為0.22 ng，鹽酸多巴胺的檢測限為2.35 ng;去甲豬毛菜堿的檢測限為2.63 ng，尿苷的檢測限為0.55 ng和鳥苷的檢測限為0.37 ng;當信噪比為10時，測得尿嘧啶的定量限為0.71 ng，鹽酸多巴胺的定量限為5.73 ng;去甲豬毛菜堿的定量限為7.87 ng，尿苷的定量限為1.09 ng和鳥苷的定量限為1.46 ng。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取供試品溶液 (S1)50 μL，連續進樣6次，記錄峰面積，尿嘧啶，鹽酸多巴胺，去甲豬毛菜堿，尿苷和鳥苷的RSD分別 為 0.66%，0.91%，0.50%，0.53%， 和0.74%，表明儀器精密度好。

2.4.4 重復性試驗 取附子粉末 (S1)6份，按2.3項下制成供試品溶液，精密吸取供試品溶液各50 μL，注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，計算。尿嘧啶的平均質量分數為9.4×10－3mg/g(RSD=1.41%);鹽酸多巴胺的平均質量分數為 8.7×10－2mg/g(RSD=1.16%);去甲豬毛菜堿的平均質量分數為1.3 mg/g(RSD=0.84%);尿苷的平均質量分數為2.9×10－1mg/g(RSD=1.12%);鳥苷的平均質量分數為1.7×10－1mg/g(RSD=0.95%)(n=6)。

2.4.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液 (S1)于0、1、2、4、8、24 h進樣測定，尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷和鳥苷峰面積的RSD分別 為 0.93%、0.80%、0.70%、0.56% 和0.80%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.6 回收率試驗 取已知含有量的附子粉末(S1)6份，精密稱取約0.5 g，分別精密加入一定量的尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷和鳥苷對照品，按2.3項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算加樣回收率。尿嘧啶的平均回收率為98.76%(RSD=1.86%);鹽酸多巴胺的平均回收率為102.59%(RSD=1.37%);去甲豬毛菜堿的平均回收率為101.68%(RSD=0.80%);尿苷的平均回收率為100.06%(RSD=0.51%);鳥苷的平均回收率為102.24%(RSD=0.78%)(n=6)。

2.4.7 樣品測定 取附子樣品，分別按2.3項下方法制成供試品溶液，依法測定，計算尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷、鳥苷的質量分數，結果見表1。

表1 附子藥材測定結果Tab.1 Determination results of samples

3 討論

3.1 流動相的選擇 參考文獻方法［7-10］，本實驗經進一步優化，最終確定流動相為0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脫，在此色譜條件下，樣品中尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷和鳥苷與其它色譜峰分離良好，且與對照品DAD光譜一致。本實驗還比較了十八烷基硅烷鍵合硅膠柱 (Eclipse XDB C18，Phenomenex Luna C18)和五氟苯基柱(Phenomenex Luna PFP)，結果顯示五氟苯基柱分離效果更佳。

3.2 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器考察了尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷和鳥苷的DAD光譜，結果顯示:核苷類成分尿嘧啶、尿苷和鳥苷在260 nm有最大吸收，鹽酸多巴胺和去甲豬毛菜堿在280 nm有最大吸收，故分別選擇260 nm和280 nm作為檢測波長。

3.3 提取方法的考察 本實驗考察了水、酸水、30%甲醇、50%甲醇、30%甲醇 (含0.45%鹽酸)和50%甲醇 (含0.45%鹽酸)對提取效果的影響，結果表明以酸水提取效果最佳;對酸水濃度(0.025、0.05、0.1、0.2 mol/L)進行了考察，表明對測定結果無明顯影響，故本實驗用0.05 mol/L鹽酸溶液提取。此外，還比較了回流與超聲對提取效果的影響，結果表明二者無明顯差異，故選擇簡便的超聲提取。

3.4 結果分析 本實驗建立了HPLC-DAD法同時測定附子中5種水溶性成分，方法簡便可行。結果顯示，不同來源的生附子及炮制品中5種水溶性成分的量差異較大，從總體趨勢來看，生附子水溶性成分的含有量明顯高于炮制品，表明附子產地及其加工炮制對水溶性成分有顯著影響，炮制對附子水溶性成分損失嚴重，部分炮制品中水溶性成分已檢不出。附子水溶性成分具有顯著的強心和升壓作用，因此，有必要測定其代表性主要成分，才能更好地反應、控制附子的質量和有效性。本實驗為附子炮制及其質量控制提供了新的參考方法。

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