高效液相色譜法同時測定郁金中5種成分

王麗瑤， 王永祿， 陳琳琳

(1.安徽農業大學生命科學學院，安徽合肥 230036;2.南京工業大學藥學院，江蘇南京 210009)

郁金為臨床常用中藥，其基原復雜。2010年版《中國藥典》收載郁金為姜黃屬植物溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling、姜黃Curcuma longaL.、廣西莪術Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Ling或蓬莪術Curcuma phacocaulisVal.的干燥塊根，分別習稱為“溫郁金”、“黃絲郁金”、“桂郁金”或“綠絲郁金”［1］。郁金中的主要活性成分為姜黃素及倍半萜類成分［2］。其中姜黃素類成分主要有姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素等;倍半萜類成分主要有芳姜黃酮、bisacurone等［3-5］。不同基原郁金藥材的化學成分有所不同，質量差異較大［6-7］。目前， 《中國藥典》2010年版尚無郁金的定量測定內容，文獻中多見對某種郁金揮發油類成分的GC-MS分析或對姜黃素的定量測定［8-12］。因此，有必要建立簡單可行的分析方法對不同基原郁金的姜黃素及倍半萜類成分進行綜合分析，以期為郁金的質量控制、臨床用藥的安全有效提供參考依據。

1 儀器與材料

Agillent 1200型高效液相色譜儀 (二極管陣列檢測器、四元泵、柱溫箱、化學工作站);Diamonsil C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)。對照品姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮為實驗室自制，采用HPLC峰面積歸一化法測定，純度均大于98%。乙腈 (色譜純，Merck公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。從不同產地收集郁金藥材共9件，經王麗瑤鑒定，安徽農業大學中藥資源教研室陳琳琳教授復核，9件郁金藥材分別為溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling、姜黃Curcuma longaL.、廣西莪術Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Ling、蓬莪術Curcuma phacocaulisVal.的塊根，即分別為溫郁金、黃絲郁金、桂郁金及綠絲郁金。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器分別對5種成分進行掃描，3種姜黃素類化合物的最大吸收波長分別為姜黃素426 nm、去甲氧基姜黃素423 nm、雙去甲氧基姜黃素417 nm;倍半萜類化合物的最大吸收波長分別為bisacurone B 242 nm、芳姜黃酮240 nm。為兼顧各組分的檢測信號強度和靈敏度，最終選取420 nm作為姜黃素類化合物的檢測波長;240 nm作為倍半萜類化合物的檢測波長。

2.2 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈－0.6%冰乙酸溶液梯度洗脫 (0～10 min，27%乙腈;10～14 min，27% ～50%乙腈;14～24 min，50%乙腈;24～36 min，50%～90%乙腈);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進樣量20 μL;檢測波長為240 nm、420 nm。在此色譜條件下，3種姜黃素類成分及2種倍半萜類成分分離良好，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液 (A)和供試品溶液 (B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixture referencesolution(A)and sample solution(B)

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 分別取對照品姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮適量，精密稱定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含上述對照品 0.210 2、0.095 6、0.090 7、0.125 8、0.269 9 mg/mL的混合對照品貯備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取郁金藥材細粉約1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，減壓回收甲醇，殘渣加甲醇使溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 將2.3.1項下制備的對照品貯備液由高至低逐級稀釋制得系列質量濃度的對照品溶液。精密吸取不同質量濃度的對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按2.2項下色譜條件測定，分別記錄姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，得到3種姜黃素類成分及2種倍半萜類成分的回歸方程，結果見表1。

表1 3種姜黃素類成分及2種倍半萜類成分的回歸方程和線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges for the three curcuminoids and two sesquiterpenes

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，按2.2項下色譜條件測定，結果姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積RSD分別為1.24%、1.12%、1.07%、0.93%、0.86%，精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取郁金樣品約1.0 g，精密稱定，共取6份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液20 μL，按2.2項下色譜條件注入液相色譜儀，測定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積積分值，計算，結果上述5種成分的RSD分別為1.67%、1.46%、1.25%、1.36%、1.97%，重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別在0、2、4、6、8、12 h按2.2項下色譜條件注入液相色譜儀，測定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積積分值，結果上述5種成分的RSD分別為 2.03%、1.86%、1.92%、1.03%、0.96%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.4.5 最低檢測限 取混合對照品溶液逐步稀釋后，注入高效液相色譜儀，以峰高為基線噪音3倍計，測得姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的最低檢測限分別為0.105 075、0.095 6、0.090 7、0.062 9、0.134 95 μg/mL。

2.4.6 加樣回收率實驗 取已知含有量的郁金樣品約0.5 g，精密稱定，共取9份，分3組，每組3份，每組按樣品中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮各自含有量的80%、100%、120% 分別精密加入對照品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液20 μL，按2.2項下色譜條件注入液相色譜儀，測定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮，計算加樣回收率。結果上述5種成分的平均加樣回收率分別為 97.05%、97.35%、98.76%、101.28%、97.27%，RSD分別為1.79%、1.06%、0.95%、1.38%、1.85%，方法準確性良好。

2.5 樣品測定 取郁金樣品約1.0 g，精密稱定，按2.3.2項下方法每個樣品平行制備供試品溶液2份，分別精密吸取各供試品溶液20 μL，按2.2項下色譜條件測定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積積分值，根據標準曲線計算，結果見表2。

表2 郁金中5種成分的測定結果Tab.2 Results of determination of five compounds in Curcumae Radix

3 討論

3.1 供試品制備條件的優化 在供試品溶液制備過程中，分別對提取方式 (回流、超聲)、提取溶劑 (甲醇、乙醇、乙酸乙酯)及用量、提取時間進行了考察，結果表明用50 mL甲醇加熱回流提取0.5 h為最佳提取條件。

3.2 流動相的選擇 分別采用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.6%冰乙酸、乙腈-0.1%磷酸等系統進行梯度洗脫實驗。結果表明，如果流動相中不加酸，姜黃素類化合物的峰形較差。乙腈-0.6%冰乙酸系統的條件為最佳，冰乙酸對色譜峰峰形的改善具有較好的效果，且基線穩定，分析周期短，得到了滿意的分析結果。

3.3 不同基原郁金藥材測定結果分析 對不同基原郁金藥材測定結果進行分析，發現黃絲郁金藥材中各指標成分的量均較高，其它3種郁金藥材中各指標成分量均較低。結合已有研究結果［6］，認為不同種姜黃屬植物的塊根均作為郁金藥用質量相差甚大，難以保證臨床用藥的安全有效，有必要對藥材質量做進一步的規范;同時建議種植高品質的郁金品種。

3.4 小結 本實驗建立了HPLC法同時測定郁金藥材中3種姜黃素類成分和2種倍半萜類成分;測定了9批4種不同基原的郁金藥材，反映了不同基原郁金藥材質量的優劣。該方法簡便、快速、準確，能夠為郁金藥材的質量評價提供一定的參考。

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