HPLC法快速定量測定硫酸長春新堿

袁 琦， 徐 玫， 趙 輝， 楊 浩

(河南大學藥學院，河南開封 475004)

長春花為夾竹桃科植物長春花Catharanthus roseus的全草，迄今從中已經分離出70余種生物堿，其中對長春新堿和長春堿的應用最為廣泛［1］。長春新堿是二聚吲哚類化合物，主要存在于長春花葉中，是臨床常用的一種廣譜抗腫瘤藥，主要用于治療急性淋巴細胞性白血病、霍奇金病和惡性淋巴瘤等［2］。

長春新堿為白色粉末，具有引濕性，遇光或熱易變黃，2010年版《中國藥典》(二部)用紫外分光光度法測定注射用硫酸長春新堿粉針劑［3］。目前隨著各種新劑型的不斷出現，其所用輔料的不斷變化，可能會對紫外分光光度法定量測定造成一定的干擾。而高效液相法由于其分離效能高，靈敏度好等優點，可用于硫酸長春新堿類制劑的定量測定［4-10］。本實驗研究了利用高效液相色譜法測定注射用硫酸長春新堿粉針劑的條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters—e2695高效液相色譜儀 (Waters公司)，Waters—2489可變波長紫外檢測器 (Waters公司)，UV—1600型紫外可見分光光度計 (北京瑞利)，BP—211D電子天平 (德國Sartorius)。

1.2 試劑及樣品 甲醇為色譜純，水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純。粉針劑硫酸長春新堿 (廣東嶺南制藥有限公司);硫酸長春新堿對照品 (中國藥品生物制品檢定所，純度97.5%)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取硫酸長春新堿對照品1.024 4 mg，加流動相定量稀釋至5.0 mL，搖勻，作為對照品溶液，用前新鮮配制。

2.1.2 供試品溶液的制備 取硫酸長春新堿粉針劑1瓶，精密稱定，加流動相1 mL溶解轉入5 mL量瓶，并用流動相多次洗滌容器，洗液并入量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，既得。

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 檢測波長的選擇 取一定質量濃度的硫酸長春新堿標準溶液 (溶劑為流動相)，以流動相作為參比，于190～340 nm波長范圍內掃描。由紫外圖可知，硫酸長春新堿在220 nm、240 nm和297 nm波長有三個吸收峰［11］。為了避開干擾峰的影響，本實驗選擇297nm作為檢測波長。

2.2.2 色譜條件 以Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱，甲醇-乙腈-0.5%三乙胺水溶液 (20∶20∶60，以冰醋酸調節pH=3)為流動相，體積流量1.0 mL/min，檢測波長為 297 nm，進樣量 20 μL，柱溫25℃。

2.2.3 系統適用性實驗 分別取對照品溶液和供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件進樣，得圖1。由圖1可知，硫酸長春新堿能夠完全分離，無相鄰色譜峰干擾，峰形良好，理論塔板數按硫酸長春新堿色譜峰計算不低于5 000。

圖1 硫酸長春新堿溶液的色譜圖

2.3 方法考察

2.3.1 精密度 吸取對照品溶液，重復進樣6次，記錄峰面積，RSD為0.05%。

2.3.2 重復性 取同一批次硫酸長春新堿粉針劑 (批號090803)，按2.1.2項下制備供試品溶液6份，進樣，以外標法計算，硫酸長春新堿測定結果的RSD為0.08%。

2.3.3 穩定性 按2.1.2項下方法配制供試品溶液，分別于溶解后10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h進樣，測定硫酸長春新堿的峰面積，其結果見表1。

由結果可知，藥品在前4 h，峰面積逐漸減小，4 h后趨于平穩。說明硫酸長春新堿溶液不穩定，易發生變化。但在前30 min，峰面積變化較小，即硫酸長春新堿溶液在最初的30 min基本穩定，可用于定量測定。

表1 藥品穩定性

2.3.4 線性范圍 精密稱取硫酸長春新堿對照品1.994 4 mg，加甲醇定量溶解，配制成 398.88、299.16、199.44、99.72、49.86 μg/mL的溶液，各取20 μL進樣。以色譜峰面積為縱坐標，以溶液中硫酸長春新堿的質量濃度為橫坐標，回歸方程為Y=2.300 6X+2.385 7，R2=0.998 2。結果表明，硫酸長春新堿在49.86～398.88 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.3.5 加樣回收率試驗 取9個10 mL量瓶中，分別精密加入已知質量濃度供試品溶液4.0 mL，再分別加入3.0、4.0、5.0 mL對照品溶液，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備低、中、高3種質量濃度的供試品溶液，每個質量濃度制備3份樣品。按樣品測定項下方法測定，計算回收率，結果見表2。

實驗結果表明，硫酸長春新堿的平均回收率為101.28%，RSD為0.471%，本法具有良好的回收率。

2.4 樣品測定 取不同批號的硫酸長春新堿粉針劑，每批取3份，按2.1.2項下方法制得供試液，每份樣品進樣2次，測得的峰面積代入回歸方程計算，結果見表3。

表2 樣品回收率實驗

表3 硫酸長春新堿粉針劑的測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 穩定性 圖2為長春新堿的化學結構圖，由圖可知，長春新堿分子中具有3個酯鍵，在溶液中受到氫鍵作用，易發生解離，所以長春新堿的穩定性較差，為了測定結果的準確性，應選擇較快速的測定方法，如《中國藥典》采用UV法測定硫酸長春新堿粉針劑的量［3］。通過穩定性實驗發現，在溶液配制最初的30 min內，峰面積隨時間變化較小，隨后變化逐漸增大。推斷可能是由于氫鍵對酯鍵的破壞是需要一定的能量累積，所以在最初的30 min內長春新堿基本無變化。為了證實這一推斷，又考察了硫酸長春新堿溶液在220 nm處的穩定性，得圖3。由圖3可以明顯發現，在最初階段，基本無分解產物的色譜峰，隨時間延長，分解產物的色譜峰逐漸增大，與本實驗的推斷相符。而到4 h基本穩定時，分解產物總的峰面積與硫酸長春新堿的峰面積比為3.3%，未超出《中國藥典》中規定5%的雜質最大允許量［3］，說明氫鍵對酯鍵的解離作用，不影響硫酸長春新堿粉針劑的用藥安全性。

圖2 長春新堿的化學結構

圖3 硫酸長春新堿溶液在220 nm的色譜圖

3.2 檢測波長的選擇 由硫酸長春新堿對照品的紫外吸收光譜可知，硫酸長春新堿在220 nm、240 nm和297 nm波長處有3個吸收峰，其中220 nm處吸收峰最大。分別以這3個檢測波長，進樣測定。發現以297 nm為檢測波長，樣品基本無干擾峰，說明干擾組分在297 nm無吸收，所以選擇297 nm為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 文獻報道中利用HPLC法測定硫酸長春新堿，流動相多采用甲醇-磷酸鹽系統［12-13］。由于硫酸長春新堿分子中含有4個N雜環，具有較強的堿性，易產生拖尾。在選擇流動相時，分別考查了不同的流動相，以0.04 mol/L磷酸緩沖液-甲醇 (60∶40，pH=3)和0.5%三乙胺-甲醇 (60∶40，冰醋酸調pH為3)為流動相，硫酸長春新堿色譜峰均有不同程度的拖尾，故采用0.5%三乙胺-甲醇-乙腈 (60∶20∶20，冰醋酸調pH為3)為流動相。

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