銀屑靈中芍藥苷在大鼠組織中分布研究

史長燦， 趙瑞芝，2， 盧傳堅，2*

(1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510405;2.廣東省中醫藥科學院，廣東廣州 510006)

銀屑靈片為廣東省中醫院制劑，此方多用于治療血虛風燥型銀屑病，在臨床以及實驗研究證實，療效確切［1-8］。目前是我院治療銀屑病的常規用藥，其主要由赤芍、土茯苓、莪術等成分組成。銀屑靈復方中含有的成分芍藥苷，具有抗炎、抗過敏，調節免疫、抑制角質顆粒細胞增生等與銀屑病治療相關的藥理活性［9-14］，是銀屑靈的主要活性成分之一。藥物體內分布與藥效和毒性息息相關，為了給銀屑靈的后期開發奠定基礎，本實驗建立了芍藥苷體內分布研究方法，并進行了其體內分布的研究。

1 材料與儀器

1.1 動物 SD雄性大鼠，SPF級，體質量 (300±40)g，廣東省醫學實驗動物中心 ［合格證號:0081750］，自由飲水進食。

1.2 儀器 Agilent1200HPLC，VWD檢測器 (Agilent);勻漿儀 (IKA，T10);渦旋器 (IKA型號GENIUS3);單道移液器 ACURA 825(20 ～200 μL，100 ～1 000 μL，瑞士);電子分析天平 (BT—125D);waters HLB spe柱;超低溫冰箱 (U-570，NEW BRUNSWICK);高速離心機 (G20);Waters20固相萃取儀 (Waters);超純水機 (Milli-Q，Millipore)。

1.3 試劑與藥品 銀屑靈藥材 (康美藥業)，藥物提取液(廣東省中醫院中藥制劑實驗室制備);芍藥苷 (純度96.5%，南京澤郎醫藥科技有限公司);甲醇 (色譜級，天津四友);乙腈 (色譜級，迪馬);乙酸 (色譜純，天津富宇精細化工試劑公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 分離條件 色譜柱Kinetex C18，(2.6 μm，4.6 mm×100 mm)，檢測器 VWD，柱溫 30℃，體積流量 1.2 mL/min，檢測波長275 nm。甲醇-乙腈-0.5%冰乙酸梯度洗脫，見表1。

表1 流動相條件

2.2 標準品溶液配制 精密稱取適量芍藥苷，用70%甲醇溶解制成質量濃度為1.6 mg/mL對照品貯備液，放置4℃冰箱中保存。

2.3 給藥與樣品采集 12只SD雄性大鼠隨機分為兩組。一組按照8.3 g/kg灌胃給予銀屑靈連續灌胃6 d，最后一次灌胃2 h后麻醉處死，取出心、肝、脾、肺、腎、腦各組織，另一組按照110 g/kg劑量一次給予大鼠銀屑靈，給藥后2 h處死動物，同上述操作取材，分別將心、肝、脾、肺、腎、腦用生理鹽水清洗，用濾紙吸去表面水分，放置在－80℃冰箱中備用。

2.4 樣品處理

2.4.1 樣品準備 將置－80℃冰箱中保存的組織放至室溫并用濾紙吸干水分，取1 g左右并精密稱定質量，加入10倍體積 (w/v)生理鹽水，在冰浴中進行勻漿。

2.4.2 處理方法 加入1.0 mL甲醇將spe萃取柱進行活化，再加入1.0 mL純水洗去甲醇，將組織液高速離心后取200 mL加入到spe柱，靜置流出組織液后，加1.0 mL的水，靜置流出并抽去水分，加1.0 mL甲醇洗脫spe柱并用EP管收集，置氮吹儀下吹干，再用200 μL的70%甲醇溶解，過 0.22 μL 濾膜，進樣 10 μL。

3 結果

3.1 方法專屬性 取空白組織液和加入對照品的組織液按照2.4.2項方法處理后分別進樣測定，以肝臟組織為例，色譜圖見圖1。結果表明，芍藥苷的保留時間是3.20 min，組織中的內源性物質對測定結果沒有影響，專屬性較好。其他組織專屬性圖與肝臟相近。

圖1 大鼠肝臟樣品色譜圖

3.2 標準曲線與線性范圍 將大鼠空白組織液，加入系列芍藥苷對照品儲備溶液，配制成質量濃度為1.6、3.2、8.0、16、40、80、160 μg/mL系列標準組織溶液，按照2.4.2項方法處理樣品，以芍藥苷質量濃度 (X)為橫坐標，以待測圖譜峰面積 (Y)為縱坐標，采用加權 (1/x2)最小二乘法進行回歸，得回歸方程。各組織標準曲線和相關系數見表2。

3.3 精密度與準確度 根據不同組織的標準曲線范圍，取三份組織勻漿液加入不同質量濃度的芍藥苷對照品溶液，制備成3.2、16、80 μg/mL的低、中、高3個質量濃度的QC樣品，并將3個質量濃度分別制備5份，按2.4.2項下處理后，連續測定3 d，分別計算日內精密度、日間精密度及準確度。見表3。

表2 不同組織的標準曲線及相關系數

3.4 提取回收率 取芍藥苷對照品組織液低、中、高3個質量濃度的QC樣品，每個質量濃度5份，按2.4.2項下的方法處理，進樣測定得到相應峰面積A;另取相同低、中、高3種質量濃度的芍藥苷對照品，上樣測定得到相應峰面積B，將峰面積A與B比較，得到提取回收率，見表3。芍藥苷在不同組織中的提取回收率在78.3%～88.7%。

表3 精密度、準確度及提取回收率 (n=6)

3.5 穩定性 分別將芍藥苷低、中、高3個質量濃度的QC樣品循環凍融3次 (－80℃)，以相同方法處理分析，結果顯示，測定值和真實值RSD均小于11%，說明樣品在考察的條件下比較穩定;處理后的樣品在4℃放置24 h，室溫放置12 h，經分析樣品都比較穩定。

3.6 大鼠以8.3 g/kg劑量 (臨床劑量)灌胃銀屑靈，2 h后僅血液中可檢測到芍藥苷，組織內未見芍藥苷，按常規劑量標準給藥未能測出組織分布;一次大劑量給予銀屑靈110 g/kg后，組織中芍藥苷質量濃度結果見圖2。

圖2 灌胃銀屑靈后大鼠各組織芍藥苷質量濃度

4 討論

姜清華、鄧晶晶等進行了大鼠灌胃赤丹丸芍藥苷的體內分布研究，其結果與本實驗的不同，由于灌胃的藥物處方相差比較大，配伍的成分可能會對芍藥苷組織分布內有較大的影響。

按照臨床劑量換算的動物劑量給予大鼠銀屑靈，芍藥苷僅在血液中可檢測到，說明正常劑量時芍藥苷僅分布于血液，提示后續工藝研究可直接用血液藥代動力學數據代表服用銀屑靈后芍藥苷的體內過程進行制劑工藝的優化。

大劑量時芍藥苷主要分布于肝、腎。芍藥苷具有肝保護作用，大劑量時主要分布于肝臟，對于減少處方中其它藥物的肝損傷有積極意義。

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