壯藥金邊螞蟥質量標準研究

陸崢琳， 黃瑞松*， 潘紅平， 蘇 青， 周維海

(1.廣西民族醫藥研究院，廣西南寧 530001;2.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530005;3.南寧市科康生物科技有限責任公司，廣西南寧 530007)

金邊螞蟥系醫蛭科動物菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson的干燥全體。原動物在我國主要分布于福建、臺灣、廣東、廣西、海南和香港［1］，廣西全區各地均有分布，現廣西已有人工養殖［2-4］。金邊螞蟥為廣西壯醫使用的藥材，俗名螞蟥、水蛭、肉鉆子、馬鱉、水麻貼等。壯醫認為，其可調龍路，散瘀腫，用于京瑟(閉經)、唄農 (瘡癰)、麻邦 (中風)、扭像(扭挫傷)等癥［5］。文獻記載，本品為吸血類牛蛭，主要含天然水蛭素和類組織胺合物［6-8］，其中水蛭素具有抗凝、纖溶、抑制血小板聚集、降低全血黏度、降血脂、抗血栓等作用［9-13］。目前《中國藥典》尚未收入本品，該藥材一直處于無標準狀態中，致使該藥材使用和檢驗無標準可依，難以控制該藥材質量，影響臨床用藥的安全有效。為進一步開發利用金邊螞蟥資源，本實驗收集了不同批次的樣品，對其藥材性狀、TLC鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、酸堿度、抗凝血酶活性的定量等進行研究，制訂金邊螞蟥質量控制標準。

1 儀器與試藥

硅膠G、H薄層板 (海洋牌，青島海洋化工廠分廠，批號20110608;銀龍牌，煙臺化工研究所，批號20110412)，800型離心沉淀器 (上海手術器械廠)，1/105分析天平 (X205BDU，瑞士梅特勒公司)，雷磁PHS-3C測試儀 (上海精密科學儀器有限公司)， (牛)纖維蛋白原 (Sigma公司，F8630 9001-32-5)，凝血酶凍干粉 (河南欣泰有限公司，批號20090703)，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。金邊螞蟥對照藥材采自陸川縣米場鎮南中村，其余10批次藥材采集地見表1，樣品均經過廣西大學動物科學技術學院潘紅平教授鑒定為醫蛭科動物菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson。

表1 10批金邊螞蟥產地和收集時間Tab.1 Habitats and collecting time of Poecilobdella manillensis Lesson

2 方法與結果

2.1 性狀特征 見圖1。呈長橢圓形、長條形，扭曲或扁平，柳葉狀，長4～13 cm，體寬0.3～1.2 cm，體厚0.05～0.1 cm。背部黑色或黑褐色，有少許環節突起;腹面黑色，較光滑。前端略尖，后端鈍圓，兩端各具一吸盤，前吸盤不顯著，后吸盤圓大。質脆，斷面膠質狀，黑色。氣腥臭，味咸。

2.2 薄層鑒別一

2.2.1 供試品和對照藥材溶液制備 取10批金邊螞蟥藥材各1 g，加乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，取濾液作為供試品溶液;另取金邊螞蟥對照藥材1 g，同上法制成對照藥材溶液。

圖1 金邊螞蟥藥材Fig.1 Materia medica of Poecilobdella manillensis Lesson

2.2.2 薄層鑒別及結果 照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取供試品溶液2～4 μL，對照藥材溶液3 μL，分別點于同一硅膠G預制板 (青島海洋化工廠)上，以環己烷-乙酸乙酯 (4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果表明，10批供試品色譜中，日光下檢視在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點;紫外光燈 (365 nm)下檢視則顯相同的橙色熒光斑點。本方法分離效果好，斑點集中清晰，比移值適中，重現性好。見圖2、3。

圖2 金邊螞蟥TLC圖 (可見光色譜)Fig.2 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(visible chromatography)

2.3 薄層鑒別二

2.3.1 供試品、對照藥材和對照品溶液制備 取10批金邊螞蟥藥材各1 g，加70%乙醇5 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液;另取金邊螞蟥對照藥材1 g，同上法制成對照藥材溶液;再取亮氨酸對照品、纈氨酸對照品、丙氨酸對照品、谷氨酸對照品，加70%乙醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

圖3 金邊螞蟥TLC圖 (紫外光色譜)Fig.3 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(UV chromatography)

2.3.2 薄層鑒別及結果 照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取供試品溶液3～8 μL，對照藥材溶液4 μL，混合對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G預制板 (青島海洋化工廠)上，以苯酚-水 (3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果表明:10批供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，本方法分離效果好，斑點集中清晰，比移值適中，重復性好。見圖4。

圖4 金邊螞蟥TLC色譜圖 (可見光色譜)Fig.4 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(visible chromatography)

2.4 檢查 水分、總灰分、酸不溶性灰分、酸堿度和醇溶性浸出物的測定分別參照2010年版《中國藥典》一部附錄ⅨH水分測定法第一法、IX K灰分測定法、Ⅶ G酸堿度測定法、X A醇溶性浸出物測定法中的熱浸法進行。結果見表2。

表2 10批金邊螞蟥水分、總灰分、酸不溶性灰分、酸堿度及乙醇浸出物含有量的測定Tab.2 Water content，total ash，acid-insoluble ash ，pH value and alcohol-solubleextracts of Poecilobdella manillensis Lesson

2.5 抗凝血酶活性測定

2.5.1 測定方法 采用凝血酶滴定法:取金邊螞蟥藥材粉末約0.5 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液15 mL，充分攪拌，浸提45 min，并時時振搖，離心，精密量取上清液100 μL，置于小試管中，加入含0.5%纖維蛋白原 (以凝固物計)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液 (取0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液25 mL與0.1 mol/L鹽酸溶液約40 mL，加水至100 mL，調節pH值至7.4)200 μL，搖勻，置水浴 (37℃ ±0.5℃)中以每分鐘5 μL的速度緩緩滴加凝血酶溶液 (40單位/mL)，邊滴加邊輕輕搖勻，至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計算:U=C1V1/C2V2。U為每1 g含凝血酶活性單位。中和一個單位的凝血酶的量，為一個抗凝血酶活性單位;C1(U/mL)為凝血酶溶液濃度;C2(g/mL)為供試品溶液質量濃度;V1(μL)為消耗凝血酶溶液的體積;V2(μL)為供試品溶液的加入量。

2.5.2 方法學考察

2.5.2.1 專屬性試驗 按上述測定方法，不加金邊螞蟥藥材粉末制備供試液，滴加凝血酶溶液，供試液不會凝固。說明用本方法測定金邊螞蟥藥材抗凝血酶活性無陰性溶劑干擾，專屬性強。

2.5.2.2 精密性試驗 取同一對照藥材供試品溶液6份，按2.5.1項的方法分別測定。結果顯示，6次測定的抗凝血酶活性平均值為269.2 U/g，RSD為0(n=6)。

2.5.2.3 重復性試驗 取同一對照藥材粉末6份各0.5 g，精密稱定，按2.5.1項平行測定6次。結果顯示，6份樣品的抗凝血酶活性平均值為269.3 U/g，RSD 為0.12%(n=6)。

2.5.3 樣品測定 取10批次金邊螞蟥藥材，按2.5.1項方法進行測定。結果見表3。

表3 10批金邊螞蟥抗凝血酶活性測定結果 (n=2，按干燥品計)Tab.3 Results of antithrombin activity of Poecilobdella manillensis Lesson(n=2，Calculate according to drying products)

3 討論

2010年版《中國藥典》一部收載的水蛭藥材為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman或柳葉螞蟥Whitmania acranulataWhitman［14］。《中國藥典》收載的水蛭都是非吸血類，其性狀背部黑褐色或黑棕色，腹面棕黃色。試驗所用金邊螞蟥則為吸血類，其全身均為黑褐色，與《中國藥典》收載的水蛭外觀性狀有區別。

薄層鑒別方法一，展開劑比較了環己烷-乙酸乙酯 (4∶1)、正己烷-乙酸乙酯 (4∶1)、石油醚-三氯甲烷 (1∶1)。結果環己烷-乙酸乙酯 (4∶1)系統分離得到的斑點顯色后清晰，Rf值適中。顯色方式比較了3種:10%硫酸乙醇溶液顯色后分別置于日光及紫外光燈 (365 nm)下觀察、5%磷鉬酸溶液顯色后日光下觀察及硫酸-醋酸酐 (1∶3)溶液顯色后分別置于日光下及紫外光燈 (365 nm)下觀察。結果采用10%硫酸乙醇溶液顯色，主斑點顯色清晰;5%磷鉬酸溶液顯色有背景干擾;硫酸-醋酸酐 (1∶3)溶液顯色，日光下主斑點欠清晰，紫外光燈 (365 nm)下有背景干擾。

薄層鑒別方法二，展開劑比較了苯酚-水(3∶1)、正丁醇-醋酸-甲酸-水 (4 ∶1 ∶0.1 ∶1)、正丁醇-冰醋酸-水 (3∶1∶1)三種。結果以苯酚-水 (3∶1)展開較其余二者效果好，故采用之。

本實驗還對TLC鑒別方法進行了耐用性試驗，即對不同品牌預制板 (青島海洋化工廠提供，批號20110608;煙臺市化工研究所提供，批號20110412)、不同展開溫、濕度 (溫度8℃或30℃，相對濕度50%或88%)和點樣方式 (點狀和條帶狀點樣)等展開效果進行考察。結果上述各種條件下的展開效果均較好，表明本方法的耐用性良好。

由表2可知，10批金邊螞蟥藥材水分在7.6%～14.3%，平均水分為10.2%?？紤]到該藥材為南方所產，而南方氣候較為濕潤，藥材在運輸和貯存過程中發生變化等因素，因此，將本品水分擬訂為不得過15.0%。10批樣品的總灰分為1.7%～3.8%，平均值為2.5%;酸不溶性灰分為0.1%～0.3%，平均值為0.2%;pH值為5.9～7.3，平均值為6.7;醇溶性浸出物含有量為9.4%～21.7%，平均值為16.0%。因此將本品總灰分擬定為不得過6.0%，酸不溶性灰分為不得過0.5%，pH值為5.5～7.5，浸出物含有量為不少于8.0%。

金邊螞蟥主要含天然水蛭素和類組織胺［6-8］，其中水蛭素具有抗凝、纖溶、抑制血小板聚集、降低全血黏度、降血脂、抗血栓等作用［9-13］，是該藥材的主要有效成分，故本實驗研究制訂了抗凝血酶活性的定量測定方法。該方法中有關樣品供試液制備，采用正交試驗方法，對樣品不同取樣量、不同提取時間、氯化鈉溶液不同加入量等三因素進行考察，每個因素設定三水平，采用L9(34)正交表進行試驗，考察指標為每1 g藥材所含抗凝血酶活性單位。根據試驗結果確定供試液制備方法如2.5.1項。文獻報道，寬體金線蛭Whitmania pigraWhitman、日本醫蛭Hirudo nipponicaWhitman和菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson均有不同程度的抗凝血酶活性，采用冷浸和溫浸提取，抗凝血酶活性大小為菲牛蛭＞日本醫蛭＞寬體金線蛭［15］。由表3可知，10批金邊螞蟥藥材抗凝血酶活性為244.8～298.7 U/g，平均含有量為267.2 U/g。該結果較文獻報道的數據高，考慮到藥材來源的差異，限度擬定為:本品每1 g含抗凝血酶活性應不低于220.0 U(按干燥品計)。

本研究制訂的金邊螞蟥藥材質量控制方法，現已收入《廣西壯族自治區壯藥質量標準》第二卷(2011年版)［5］，對控制該藥材質量有著積極的作用。

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