復方辣椒堿乳膏的質量標準研究

馮定軍， 丁捷飛， 胡黎鳳， 俞 偉

(寧波立華制藥有限公司，浙江寧波 315174)

復方辣椒堿乳膏對急慢性疼痛、腫脹、屈伸不利、麻木僵硬的緩解和治療效果顯著［1］，適用于局部骨骼、關節、肌肉、神經的非化膿性炎癥狀，如:風濕痛、肌肉痛、腰背痛、關節炎、肩周炎、急慢性扭傷、腱鞘炎、坐骨神經痛等［2-3］。參考文獻［4-9］對復方辣椒堿乳膏的質量標準作了研究，采用HPLC法測定辣椒堿、二氫辣椒堿、水楊酸甲酯［10］的量;采用 GC法測定樟腦、薄荷腦的量［11-12］。方法準確，靈敏，專屬性強，適于作為復方辣椒堿乳膏的質量控制標準。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀;GC 6890氣相色譜儀。辣椒堿 (批號:108H5852)、二氫辣椒堿(批號:032K7022)對照品購自SIGMA公司。薄荷腦 (批號:110747-200106)、樟腦 (批號:110728-200005)、水楊酸甲酯 (批號:110707-200609)對照品購自中國藥品生物制品檢定所。

色譜級乙腈 (天津四友公司生產)，色譜級甲醇 (天津四友公司生產)，磷酸 (分析純，天津化學試劑三廠生產)，乙酸乙酯 (分析純，昆山金誠試劑公司生產)，重蒸水 (自制)。

樣品為寧波立華制藥有限公司產品技術部試制。

2 辣椒堿與二氫辣椒堿的測定

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-phenyl(4.6 mm×150mm)色譜柱［13］;以乙腈 －0.1%磷酸溶液 (40∶60)為流動相;檢測波長為280 nm，理論板數按辣椒堿峰計算應不低于4 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取經40℃減壓干燥5 h的辣椒堿與二氫辣椒堿對照品適量，加流動相制成每1 mL約含辣椒堿0.045 mg與二氫辣椒堿0.025 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品2.5 g(約相當于辣椒堿1.5 mg)，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入乙腈10 mL，置60℃水浴中加熱，振搖使溶解，放涼至室溫，置10℃以下放置12 h，取出迅速濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液5 mL，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，再置10℃以下放置30 min，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 線性關系考察 精密稱取經40℃減壓干燥5 h的辣椒堿對照品9.05 mg與二氫辣椒堿對照品5.15 mg于50 mL量瓶中，加乙腈－0.1%磷酸溶液 (40∶60)適量使之溶解并稀釋至刻度，得質量濃度分別為181 μg/mL和103 μg/mL的對照品母液。從上述母液中精密吸取5 mL于10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，這樣逐級稀釋得5個不同質量濃度的對照品溶液，分別取20 μL進樣，記錄色譜圖、峰面積值，進行線性回歸。得辣椒堿線性回歸方程為Y=11.917 16×X+14.566 34，相關系數為0.999 95;二氫辣椒堿線性回歸方程為Y=11.984 64×X+4.169 66，相關系數為0.999 94。由回歸方程知，辣椒堿在11.312 5～181.000 0 μg/mL范圍內，二氫辣椒堿在6.437 5～103.000 0 μg/mL范圍內峰面積值與樣品質量濃度有良好線性關系。

2.4 干擾試驗 按處方比例及工藝制備不含辣椒堿和二氫辣椒堿的樣品適量，按2.2.3項下供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液，取陰性樣品溶液，按2.1項色譜條件進樣，結果在辣椒堿和二氫辣椒堿峰保留時間處無吸收峰出現。表明樣品中其他成分不干擾測定，方法專屬性強，見圖1。

2.5 精密度試驗 取2.2.1項下辣椒堿和二氫辣椒堿對照品混合液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續重復進樣5次，觀察峰面積變化的情況。測得辣椒堿峰面積的RSD為0.68%，二氫辣椒堿峰面積的RSD為0.53%。

2.6 重復性試驗 取同一批號 (20120402)復方辣椒堿乳膏樣品2.5 g，精密稱定，共6份，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液。測得辣椒堿的RSD為2.0%，二氫辣椒堿為1.3%。

2.7 穩定性試驗 取同一批號樣品，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品液，分別在0、1、2、3、4、5、6 h進行測定。測得辣椒堿峰面積的RSD為1.4%，二氫辣椒堿峰面積的RSD為1.4%，結果表明，測試溶液在6 h內其主峰面積無明顯變化，本品制備成樣品溶液可以放置6 h測定。

圖1 辣椒堿和二氫辣椒堿對照品 (A)、樣品 (B)及陰性樣品 (C)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)and negative sample(C)

2.8 回收率試驗 取已知含有量的復方辣椒堿乳膏供試品6份，分別精密加入辣椒堿對照品母液(0.181 mg/mL)和二氫辣椒堿對照品母液 (0.103 mg/mL)5 mL，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按含量測定項下要求，分別吸取上述溶液各20 μL進樣測定，按兩點外標法計算，數據見表1、表2。

2.9 樣品測定 取對照品溶液和供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣，按兩點外標法以峰面積計算辣椒堿和二氫辣椒堿的量。結果見表3。

表1 辣椒堿加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests of capsicine

表2 二氫辣椒堿加樣回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests of dihydrocapsaicin

表3 樣品中辣椒堿和二氫辣椒堿測定結果(n=3)Tab.3 Results of determination of capsicine and dihydrocapsaicin in samples(n=3)

3 水楊酸甲酯的測定

3.1 色譜條件選擇 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱 (150 mm×4.6 mm);以甲醇-水(80∶20)為流動相;檢測波長為300 nm，體積流量為1.0 mL/min。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取水楊酸甲酯對照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品0.3 g，加甲醇超聲溶解，轉移至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

3.2.3 空白對照溶液的制備 按處方比例及工藝制備方法，不加冬青油同法制備，得復方辣椒堿乳膏的冬青油空白樣品。將空白同供試品溶液的制備方法制得空白對照溶液。

3.3 線性關系考察 精密稱取水楊酸甲酯對照品4.92 mg于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質量濃度為98.4 μg/mL對照品母液。從上述母液中精密吸取5 mL于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，這樣逐級稀釋得5個不同質量濃度的對照品溶液，分別取20 μL進樣，記錄色譜圖、峰面積值，并以質量濃度為X，峰面積為Y，進行線性回歸。測得線性回歸方程為Y=22.268 74×X+2.891 43，相關系數為1.000 0。由回歸方程知，水楊酸甲酯在12.30～196.80 μg/mL范圍內峰面積值與樣品質量濃度有良好線性關系。

3.4 精密度試驗 取3.2項下配置的水楊酸甲酯對照品，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續重復進樣5次，觀察峰面積變化的情況。測得水楊酸甲酯峰面積的RSD為0.44%。

3.5 重復性試驗 取同一批號 (20120402)復方辣椒堿乳膏樣品0.3 g，精密稱定，共6份，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液。取3.2項下配置的水楊酸甲酯對照品，精密吸取20 μL，按測定項下要求測定，考察本測定方法的重復性。結果測得水楊酸甲酯的RSD為0.69%。

3.6 溶液穩定性試驗 取同一批號 (20120402)本品，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品液，按測定項下要求，分別在0、1、2、3、4、5、6 h進行測定。測得水楊酸甲酯峰面積的RSD為1.45%。

試驗結果表明，測試溶液在6 h內其主峰面積無明顯變化，本品制備成樣品溶液可以放置6h測定。

3.7 專屬性試驗 按空白樣品溶液配制方法制備樣品，精密吸取空白樣品溶液20 μL，進樣，檢測。結果陰性無干擾，本方法專屬性良好，見圖2。

圖2 水楊酸甲酯對照品 (A)、樣品 (B)及陰性樣品 (C)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of methyl salicylate(A)，sample(B)and negative sample(C)

3.8 準確度試驗 取已知含有量的復方辣椒堿乳膏供試品 (批號為20120401)6份，精密稱定，分別精密加入水楊酸甲酯對照品母液 (0.049 2 mg/mL)5.0 mL，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按測定項下要求，吸取上述溶液20 μL進樣測定，按兩點外標法計算，考察本測定方法的準確度。結果見表4。

表4 水楊酸甲酯加樣回收率試驗結果Tab.4 Results of recovery tests of methyl salicylate

由表4可知，水楊酸甲酯加樣回收率在95%～105%范圍內，符合要求。試驗結果表明，本方法的準確度良好。

3.9 樣品測定 本品3批復方辣椒堿乳膏按3.1項下色譜條件及3.2項下溶液制備方法制備供試品溶液，按兩點外標法以峰面積計算，結果見表5。

表5 樣品中水楊酸甲酯測定結果(n=3)Tab.5 Results of determination of methyl salicylate in samples(n=3)

4 樟腦，薄荷腦的測定

4.1 色譜條件 聚乙二醇20 M毛細管色譜柱;氫火焰離子檢測器;柱溫100℃;檢測器溫度220℃;分流進樣方式。

4.2 前處理方法的選擇 取裝量差異項下的內容物，混勻，精密稱取本品4 g(相當于樟腦，薄荷腦各約60 mg)，置500 mL燒瓶中，加水200 mL，連接揮發油測定器。自測定器上端加水使充滿刻度，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯4 mL，連接回流冷凝管，加熱回流3 h，靜置冷卻后，將乙酸乙酯放置具塞錐形瓶中，用乙酸乙酯適量多次沖洗冷凝管及揮發油測定器，合并乙酸乙酯液，加無水硫酸鈉適量，振搖，濾過置50 mL量瓶中，用適量乙酸乙酯洗滌錐形瓶，洗液濾入濾液中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

4.3 線性關系考察 精密稱取樟腦對照品47.27 mg與薄荷腦對照品45.39 mg于10 mL量瓶中，加乙酸乙酯適量使之溶解并稀釋至刻度，得質量濃度分別為4.727 mg/mL和4.539 mg/mL的對照品母液。從上述母液中精密吸取5 mL于10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，這樣逐級稀釋得5個不同質量濃度的對照品溶液，分別取1 μL進樣，記錄色譜圖、峰面積值，并以質量濃度為X軸，峰面積為Y軸，進行線性回歸。測得樟腦線性回歸方程為Y=1 187.656 45X+0.118 276，相關系數為0.999 95;薄荷腦線性回歸方程為Y=1 195.294 94X+1.439 70，相關系數為0.999 95。

由回歸方程知，樟腦在0.295 4～4.727 mg/mL范圍內，薄荷腦在0.283 7～4.539 mg/mL范圍內峰面積值與樣品質量濃度有良好線性關系。

4.4 精密度試驗 取樟腦和薄荷腦對照品，精密稱定，加乙酸乙酯溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含樟腦1.2 mg與薄荷腦1.2 mg的混合溶液，作為供試品溶液，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，連續重復進樣5次，觀察峰面積變化的情況。測得樟腦峰面積的RSD為0.95%，薄荷腦峰面積的RSD為0.93%。試驗結果表明，本儀器精密度良好。

4.5 重復性試驗 取同一批號 (20120402)復方辣椒堿乳膏樣品4 g，精密稱定，共6份，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液。另取4.4項下配置的樟腦和薄荷腦對照品溶液，精密吸取1 μL，按測定項下要求測定，考察本測定方法的重復性。結果測得樟腦的RSD為0.47%，薄荷腦的RSD為0.91%。結果表明本試驗方法重復性良好。

4.6 溶液穩定性試驗 取同一批號 (20120402)本品，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品液，按測定項下要求，分別在0、1、2、3、4、5、6 h進行測定。結果測得樟腦峰面積的RSD為1.61%，薄荷腦峰面積的RSD為1.72%。

試驗結果表明，測試溶液在6 h內其主峰面積無明顯變化，本品制備成樣品溶液可以放置6 h測定。

4.7 專屬性試驗 按空白樣品溶液配制方法制備樣品，精密吸取陰性樣品溶液20 μL，進樣，檢測。結果陰性無干擾，本方法專屬性良好，見圖3。

圖3 對照品 (A)、樣品 (B)及陰性 (C)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)and negative sample(C)

4.8 準確度試驗 取已知含有量的復方辣椒堿乳膏 (批號為20120402)供試品6份，精密稱定，分別精密加入樟腦對照品母液 (10.25 mg/mL)和薄荷腦對照品母液 (10.028 mg/mL)5.0 mL，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按測定項下要求，吸取1 μL進樣測定，按兩點外標法計算，考察本測定方法的準確度。

表6 樟腦加樣回收率試驗結果Tab.6 Results of recovery tests of camphor

表7 薄荷腦加樣回收率試驗結果Tab.7 Results of recovery tests of menthol

由上兩表可知，樟腦和薄荷腦加樣回收率在95%～105%范圍內，符合要求。試驗結果表明，本試驗方法的準確度良好。

4.9 樣品測定 精密稱取樟腦與薄荷腦對照品適量，加乙酸乙酯制成每1 mL約含樟腦1.2 mg與薄荷腦1.2 mg的混合溶液，作為對照品溶液;取裝量差異項下的內容物，混勻，按4.2項下前處理方法處理3批樣品，得供試品溶液。按4.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，按兩點外標法以峰面積計算，即得。測定結果見表8。

表8 樣品中樟腦和薄荷腦測定結果(n=3)Tab.8 Results of determination of camphor and menthol in samples(n=3)

5 討論

5.1 檢測波長的選擇 通過紫外可見分光光度計全波長掃描，發現辣椒堿和二氫辣椒堿在可見光區都無較大吸收，當波長為280 nm時，測定組分有較大吸收，因此本實驗選擇280 nm為辣椒堿和二氫辣椒堿的吸收波長。

5.2 流動相的選擇 參照國家標準 (試行) “辣椒堿軟膏” (標準號:WS-1023(X-763)-2002)中檢測辣椒堿和二氫辣椒堿的色譜方法，選擇乙腈－0.1%磷酸溶液 (33∶67)為流動相。為了方便研究將流動相比例作了適當調整。因為當體積流量為1.0 mL/min，乙腈 －0.1%磷酸溶液 (33∶67)時，樣品出峰需要30 min左右，出峰時間較長;若改為乙腈－0.1%磷酸溶液 (40∶60)則出峰時間在20 min內，時間上比較合理，且又不影響各組分峰形及分離度。由此選擇乙腈－0.1%磷酸溶液 (40∶60)為流動相。

5.3 柱溫的選擇 高效液相色譜分析中，柱溫是影響分離度及分析時間的因素之一［14］。一般情況下，溫度升高，可使流動相的黏度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高對分離選擇性有一定的影響，且使流動相易產生氣泡。實驗表明，隨著柱溫的升高，組分保留時間變短。隨溫度變化后兩個組分間的分離度都遠大于1.5，保留時間差足夠大，不影響分離度。但在30℃下二氫辣椒堿保留時間較長，但柱溫過高，對色譜柱的壽命有影響，因此實驗選擇40℃的柱溫。

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