酒制瑞香狼毒對荷瘤小鼠抑瘤作用及機制的實驗研究

馬曉莉， 劉晉芝， 曹松云， 王 淼， 張新穎

(河北大學中醫學院，河北保定 071000)

瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬植物Stellera chamaejasmeL.的干燥根，其味苦、辛，性平，有毒，入肝、肺、脾三經，有逐水、祛痰、破積、殺蟲之功效［1］。瑞香狼毒用于治療腫瘤在我國已有悠久的歷史。諸多文獻報道生藥狼毒既有明顯的體外抗腫瘤作用［2］，又具有非常強的體內抗腫瘤作用［3］，其含藥血清也有明顯的抗腫瘤作用［4］。但瑞香狼毒全草有毒，特別是對胸腺、脾臟等重要器官毒副作用較大。蒙醫在防病、治病的實踐中，摸索出狼毒的多種炮制方法，以達到減毒增效的目的，其中酒制狼毒有抗腫瘤作用，但炮制機理研究較少。本文通過H22荷瘤小鼠體內抑瘤實驗，考察了酒制對瑞香狼毒抑瘤作用的影響，探討其抑瘤機制，為瑞香狼毒的進一步開發、應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 狼毒購自安國市昌達中藥材飲片有限公司，留300 g作為生藥狼毒組的用藥;酒制狼毒的制備:另外取300 g狼毒飲片，制備酒制狼毒，加60°白酒 (紅星二鍋頭，北京紅星公司產品)沒過狼毒，浸泡6 h后，用文火煮至白酒完全被狼毒吸收，60℃烘干。

1.2 實驗動物與瘤株 實驗動物為雄性昆明種小鼠，體質量 (20±2)g，購自河北醫科大學實驗動物中心，實驗動物合格證號1112090。瘤株為H22小鼠腹水型肝癌細胞株，由河北大學基礎醫學院微生物免疫實驗室惠贈。

1.3 動物處理與分組 先從80只小鼠中隨機取10只不接種腫瘤，作為空白對照組;余下的70只接種腫瘤。取接種6 d腫瘤生長良好的小鼠腹水，用生理鹽水稀釋成1×106/mL，以每只0.2 mL的量接種于小鼠右側腋窩皮下，接種后24 h隨機分為7組，第一組為腫瘤對照組，其余6組為治療組，即生藥狼毒低、中、高劑量組 (低、中、高劑量分別為5、10、20 g/kg體質量的生藥狼毒藥液)，酒制狼毒低、中、高劑量組 (低、中、高劑量分別為5、10、20 g/kg體質量的酒制狼毒藥液)，空白對照組和腫瘤對照組給20 g/kg體質量的生理鹽水。接種24 h后開始灌胃1 mL，每天1次連續8 d。于停藥后次日處死小鼠，稱體質量解剖皮下瘤塊，取脾臟和胸腺，分別再稱定質量，計算腫瘤抑制率和脾、胸腺指數。

1.4 指標測定

1.4.1 體質量增長 將腫瘤對照組、狼毒生藥對照組和酒制狼毒低、中、高劑量各組小鼠在接種腫瘤后24 h稱取實驗動物體質量，并以苦味酸作標記，末次給藥后24 h再次稱取體質量并減去瘤質量，兩次體質量差即為體質量增長指標。

1.4.2 抑瘤率 按1978年全國抗癌藥物研究協會制定的《抗腫瘤藥物體內篩選規程》判定腫瘤抑制率［5］。將狼毒生藥組和酒制狼毒低、中、高劑量各組小鼠末次給藥后24 h處死動物，剝離瘤體電子天平稱定質量，計算抑瘤率。

1.4.3 脾指數的測定 將所有各組小鼠采用稱重法將小鼠稱定質量后脫頸處死，剝離脾臟，電子天平稱定質量，計算脾指數 (mg/g)。

1.4.4 胸腺指數的測定 將所有各組小鼠采用稱重法將小鼠稱定質量后脫頸處死，剝離胸腺，電子天平稱定質量，計算脾指數 (mg/g)。

1.4.5 Bax、Bcl-2免疫組織化學染色 將生藥狼毒組和酒制低、中、高劑量組小鼠脫頸椎處死后很快取出腫瘤，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規脫水、透明、包埋成石蠟切片，每張均切4 μm薄的切片，準備做免疫組化。免疫組化步驟:石蠟切片，60℃烤箱烤片20 min后，二甲苯脫蠟、不同濃度酒精脫水，3%H2O2去離子水孵育30 min，以封閉內源性過氧化物酶;0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)微波修復;自然冷卻至室溫;分別用兔抗鼠Bax和Bcl-2抗體 (Santa cruz，1∶100)孵育切片 (4℃，過夜);滴加試劑1，37℃恒溫水浴鍋濕盒內孵育20 min;滴加試劑2，37℃恒溫水浴鍋濕盒內孵育20 min;DAB避光顯色1至2 min。每步驟間用0.01 mol/L PBS充分洗滌，再經過石蠟切片的常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍攝照片。對照試驗:省去一抗或用PBS代替一抗孵育切片，結果為陰性。

1.5 統計分析

1.5.1 使用醫學圖像分析儀 (TN-8502)，鏡下觀察狼毒生藥組和酒制狼毒低、中、高劑量各組染色結果，并測定細胞灰度值，用該儀器自帶分析軟件分析相應抗體的表達量。以上四組每組取五張切片，每張切片選五個視野，計算其平均值即為該張切片的灰度值，五張切片的平均值為該組的灰度值。

2 實驗結果

2.1 酒制狼毒各組對抑瘤率的影響 生藥狼毒對荷瘤小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用，20 g/kg體質量生藥狼毒灌胃抑瘤作用最好，抑瘤率為69.45%，5、10 g/kg生藥狼毒抑瘤率為46.78%、52.34%。經過用白酒炮制后狼毒對腫瘤的抑制作用明顯增強，酒制狼毒低、中劑量組的抑瘤率分別高達98.40%、87.16%，高劑量酒制狼毒對腫瘤的抑制和生藥狼毒比有所下降，抑瘤率為50.21%。見表1。

表1 生藥狼毒和各組酒制狼毒對H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of tumor inhibition of liquor-saturated Stellera chamaejasme and crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

表1 生藥狼毒和各組酒制狼毒對H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of tumor inhibition of liquor-saturated Stellera chamaejasme and crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

注:與腫瘤對照組比較，▲P＜0.05;與生藥狼毒高劑量組比較，■P＜0.05。

組 別 瘤質量/g 抑瘤率/%腫瘤對照組0.655 6±0.416 9 －生藥狼毒低劑量組 0.545 0±0.396 6▲ 46.78生藥狼毒中劑量組 0.418 9±0.527 8▲ 52.34生藥狼毒高劑量組 0.200 3±0.176 4▲ 69.45酒制狼毒低劑量組 0.010 5±0.011 2▲■ 98.40酒制狼毒中劑量組 0.084 2±0.101 4▲■ 87.16酒制狼毒高劑量組 0.326 4±0.366 2▲50.21

2.2 酒制狼毒各組對體質量增長、脾臟和胸腺的影響 與空白對照組比較，生藥狼毒組和酒制狼毒低、中、高劑量組的體質量增長均P＞0.05，無明顯變化;與空白對照組比較，酒制狼毒低、中、高劑量各組對脾臟、胸腺的毒副作用小，脾指數、胸腺指數均P＞0.05;生藥狼毒組對脾臟、胸腺影響較大，與空白對照組比較脾指數、胸腺指數均P＜0.05;與生藥狼毒組比較，酒制狼毒低、中、高劑量各組的脾指數和胸腺指數均P＜0.05。見表2。

2.3 生藥狼毒和各組酒制狼毒對Bax及Bcl-2表達的影響 與生藥狼毒組比較，酒制狼毒各組明顯使Bax表達上調，Bcl-2的表達下調，P＜0.05有統計學意義。見表3。

表2 生藥狼毒和各組酒制狼毒對H22荷瘤小鼠體質量增長、脾指數、胸腺指數的影響 (±s，n=10)Tab.2 Effect of body weight，thymus index，spleen index in liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

表2 生藥狼毒和各組酒制狼毒對H22荷瘤小鼠體質量增長、脾指數、胸腺指數的影響 (±s，n=10)Tab.2 Effect of body weight，thymus index，spleen index in liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

注:與空白對照組比較，■P＜0.05，與生藥狼毒組比較，▲P＜0.05。

脾指數 胸腺指數空白對照組組 別 體質量增長值/g 3.970 0±1.314 9 0.452 6±0.116 9 0.257 4±0.072 5腫瘤對照組 3.554 4±2.158 1 0.403 0±0.107 4 0.228 3±0.059 1生藥狼毒組 4.259 6±2.120 3 0.213 4±0.150 9■ 0.109 3±0.084 7■酒制狼毒低劑量組 4.269 4±2.058 4 0.482 0±0.103 6▲ 0.279 6±0.435 0▲酒制狼毒中劑量組 4.705 8±1.178 4 0.475 6±0.151 0▲ 0.264 5±0.055 8▲酒制狼毒高劑量組 2.929 1±0.993 3 0.413 6±0.117 4▲ 0.253 8±0.070 5▲

表3 Bax、Bcl-2在各組酒制法狼毒和生藥狼毒組中表達的比較 (±s)Tab.3 Comparison of Bax and Bcl-2 on liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme(±s)

表3 Bax、Bcl-2在各組酒制法狼毒和生藥狼毒組中表達的比較 (±s)Tab.3 Comparison of Bax and Bcl-2 on liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme(±s)

注:與生藥狼毒組比較，■P＜0.05;與腫瘤對照組比較，▲P＜0.05。

組 別 測量視野數Bax Bcl-2生藥狼毒組 25 10.31±2.26▲ 31.24±2.58▲腫瘤對照組 25 6.23±2.18 42.38±1.86酒制狼毒低劑量組 25 28.69±2.63■▲ 12.13±2.32■▲酒制狼毒中劑量組 25 26.75±1.78■▲ 17.36±1.92■▲酒制狼毒高劑量組 25 22.31±3.27■▲ 20.45±2.76■▲

取生藥狼毒組和酒制狼毒低、中、高劑量組的腫瘤，做免疫組化常規DAB顯色，Bax表達陽性的為細胞質有棕黃色顆粒，與腫瘤對照組比較，生藥狼毒和酒制狼毒棕黃色顆粒都有增加;與生藥狼毒組比較，酒制毒低、中劑量棕黃色顆粒增加較多，高劑量增加較少 (見圖1)。

取生藥狼毒組和酒制狼毒低、中、高劑量組的腫瘤，做免疫組化常規DAB顯色，Bcl-2表達陽性的為細胞質有棕黃色顆粒，與腫瘤對照組比較，生藥狼毒組和酒制狼毒棕黃色顆粒減少;與生藥狼毒組比較，酒制狼毒低、中劑量棕黃色顆粒明顯減少，高劑量亦減少，與低、中劑量比稍高 (見圖2)。

3 討論

因昆明種小鼠和裸鼠的荷瘤率均為100%，本實驗目的是研究酒制狼毒抗腫瘤的作用及對胸腺、脾臟等重要臟器的影響，所以荷瘤小鼠選的是昆明種小鼠而非裸鼠。

圖1 生藥狼毒和各組酒制狼毒及腫瘤對照組Bax的表達 (DAB×400)Fig.1 Comparison of the expression of Bax among crude Stellera chamaejasme，groups of liquorsaturated Stellera chamaejasme and tumor contrast(DAB×400)

圖2 生藥狼毒和各組酒制狼毒及腫瘤對照組Bcl-2的表達 (DAB×400)Fig.2 Comparsion of the expression of Bcl-2 among groups of crude Stellera chamaejasme，liquorsaturated Stellera chamaejasme and tumor contrast(DAB×400)

中藥狼毒在中國被廣泛應用于治療腫瘤，其中有多種成分被發現有抗腫瘤的功能［6］。本實驗通過動物實驗證實生藥狼毒的抗腫瘤作用明顯。在表1中可以看到生藥狼毒的最大抑瘤率達到69.45%。炮制后，低、中劑量酒制狼毒抑瘤率大幅提高，尤其低劑量酒制狼毒的抑瘤率高達98.40%，中劑量酒制狼毒也達到87.16%，比同劑量生藥狼毒的抑瘤率增加，這說明用白酒炮制后能顯著提高生藥狼毒的療效。狼毒又名斷腸草［7］，對身體的危害較大，用白酒炮制后低劑量就能達到很好的抑瘤作用，這樣就可以減少狼毒的用量，從而能減輕狼毒對身體的傷害。至于高劑量酒制狼毒比生藥狼毒的抑瘤率降低，需進一步做實驗探討其機理。

經白酒炮制后既提高了狼毒的療效亦能降低其對脾臟和胸腺的損害，從表2中可以看到，與正常對照組比較，酒制低、中、高劑量組的脾指數和胸腺指數P＞0.05，說明沒有差異，經白酒炮制后狼毒的毒性明顯降低，對脾、胸腺沒有明顯損害。與正常對照組比較，生藥狼毒的脾指數和胸腺指數均P＜0.05，說明有顯著性差異，生藥狼毒對脾和胸腺的損傷較大。從表2數據可以得出，與生藥狼毒組比較，酒制低、中、高劑量各組的脾指數和胸腺指數均P＜0.05，說明經白酒炮制后確實減輕了狼毒的毒性，明顯降低了對這些免疫臟器的損傷。經白酒炮制后用較低劑量的狼毒就能達到很理想的抑瘤作用，對脾、胸腺等重要器官又沒有明顯的毒副作用，為狼毒用于臨床抗腫瘤提供新的思路。

酒制狼毒與生藥狼毒比較能顯著提高抑瘤率，其作用機制可能是使Bax的表達明顯上調，Bcl-2的表達逐漸下調。抗凋亡基因編碼的Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、細胞膜內表面、內質網膜及核膜等處［8］。它廣泛存在于造血細胞、上皮細胞、淋巴細胞、神經細胞及多種腫瘤細胞，體內和體外實驗都表明Bcl-2基因可抑制各種刺激下多種細胞的凋亡［9］。Bcl-2抗凋亡的機制目前認為主要有:①拮抗促凋亡基因bax;②抑制促凋亡的蛋白質細胞色素c自線粒體釋放到胞質;③ 阻止胞質中的細胞色素c激活caspase;④有抗氧化及維持細胞內鈣穩態等作用［10］。Bax基因屬于Bcl-2基因家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產生阻抑作用。研究發現Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，因此認為，Bax是極重要的促細胞凋亡基因之一［11］。Bcl-2基因啟動子具有NF-κB的結合位點并受其調控，故NF-κB可活化通過誘導Bcl-2及其他抗凋亡基因而阻止細胞凋亡。也可通過刺激IL-1β轉化蛋白酶、c-myc和TNF-α基因表達而導致細胞凋亡［12］。

本研究結果顯示，與腫瘤對照組比較，生藥狼毒組和各組酒制狼毒小鼠腫瘤細胞Bax蛋白表達量高，Bcl-2蛋白表達降低，從而促進了腫瘤細胞凋亡，這與前面生藥狼毒和各組酒制狼毒均有明顯的抑瘤作用一致;與生藥狼毒組比較，酒制狼毒低、中、高劑量各組小鼠腫瘤細胞Bax蛋白表達量高，Bcl-2蛋白有表達降低。表明酒制狼毒比生藥狼毒抑瘤作用提高可能是通過調控Bax和Bcl-2的表達，促進了腫瘤細胞的凋亡。

本實驗結果顯示，生藥狼毒經白酒炮制后既大大提高了抑瘤作用，又顯著降低了對胸腺、脾臟的毒副作用，臨床可考慮用酒制狼毒代替生藥狼毒入藥，但其藥效物質基礎需進一步研究。

［1］鄭寶江，胡海清.黑龍江省松嫩草地瑞香狼毒總黃酮含量的變化［J］.東北林業大學學報，2006，34(4):59-60.

［2］胡蓉蓉，王義善.瑞香狼毒抗腫瘤作用研究進展［J］.人民軍醫，2010，53(2):151-152.

［3］羅慧英，王愛勤.不同極性溶媒瑞香狼毒提取物的抗腫瘤活性比較［J］.中國臨床藥理學與治療學，2005，10(10):1140-1142.

［4］楊 柯，王義善，王莉平，等.狼毒藥理作用研究及臨床應用情況概述［J］.臨床醫學，2010，23(7):2496-2498.

［5］曹新偉，馮衛生.狼毒的化學成分研究進展［J］.河南中醫學院學報，2004，19(6):81-84.

［6］楊 柯，張京玲，黃 謙，等.狼毒水提液對人A549肺癌細胞凋亡的影響［J］.實用中西醫結合臨床，2011，11(5):88.

［7］郭曉莊.有毒中草藥大辭典［M］.天津:天津科技翻譯出版公司，1992.446.

［8］孫曉芳，段 斐，寇素茹，等.低頻電磁場對大鼠生精細胞凋亡基因表達影響［J］.中國公共衛生，2009，25(8):989-990.

［9］曹志然，戎瑞雪，王 蓓，等.馬鞭草水提取物對荷瘤小鼠抑瘤作用的實驗研究［J］.醫學研究與教育，2009，26(5):1-3.

［10］王 敏，賈正平，馬 駿，等.瑞香狼毒總黃酮提取物的抗腫瘤作用［J］.中國中藥雜志，2005，30(8):603-606.

［11］宋·唐慎微.證類本草.四庫醫學叢書［M］.上海:上海古籍出版社，1991:524-740.

［12］江蘇新醫學院.中藥大辭典·下冊［M］.上海:上海人民出版社，1977:1898.