木果楝內酯抑制人乳腺癌腦轉移細胞增殖活性的研究

李 明，劉 霞，郭書翰，董 玫，杜正倫，高鵬志，宋鐵鷹，史清文石家莊市第一醫院， 河北石家莊 0500； 河北醫科大學基礎醫學院法醫學系，河北省法醫學重點實驗室，河北石家莊 05007

近年來隨著醫療技術水平的提高，原位乳腺癌患者生存期明顯延長，但當乳腺癌發生遠處轉移時嚴重影響了患者的預后，尤其腦轉移患者預后最差[1]，且據統計，腦轉移發生率呈增加趨勢[2]。由于目前醫學界尚缺乏特效藥物降低腫瘤轉移率、延長患者生存期，因此開發可有效抑制腫瘤轉移、不良反應小、價格低廉的天然植物藥物一直是當前醫藥學界研究的熱點。楝科植物木果楝(xylocarpus granatum)是一種生長在熱帶沿海地帶的紅樹林植物，在我國主要生長于海南地區，民間用其樹皮治療赤痢，種仁用作滋補品[3-4]。已有學者發現木果楝中的植物化合物成分具有抗宮頸癌及肺癌作用[5]。本研究首次檢測了三種木果楝內酯抑制人乳腺癌腦轉移(KT)細胞增殖的效應，通過檢測凋亡相關蛋白p53、Bax和Caspase-3蛋白表達變化，探討木果楝內酯抑制人乳腺癌腦轉移細胞增殖的分子機制。

材料和方法

1 主要材料 三種木果楝內酯化合物Xylogranatin C[6]、Xylocarpin H[7]和Xylomexicanin A[8]由河北醫科大學藥學院天然藥物化學教研室從木果楝種子中純化提供，經1H-NMR檢查，純度在99%以上(圖1)；KT細胞由日本千葉大學醫學部第二生物化學教室提供，細胞培養用RPMI 1640培養基(美國，GIBCO)；噻唑藍(MTT，美國Sigma公司，M-2128)；順鉑(Cisplatin，美國Sigma，034k3693)；鼠抗Bax多克隆抗體(sc-7480)、鼠抗p53多克隆抗體(sc-1615-R)以及二抗(sc-2056，sc-2054)均為SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY產品；兔抗Caspases-3多克隆抗體(2305-PC-020；Trevigen，MD，USA)，caspase抑制劑Z-VAD-FMK(Promega，USA)。

圖 1 木果楝內酯化合物Xylogranatin C (1)、 Xylocarpin H (2)和Xylomexicanin A (3)的結構Fig. 1 Chemical structures of xylogranatins C (1), H (2) and A (3)

2 MTT法檢測木果楝內酯化合物抑制KT細胞增殖活性 取對數生長期KT細胞，0.125%胰酶消化，接種于96孔培養板，每孔含1×104個細胞。實驗分組為：溶劑對照組(含終濃度0.1% DMSO)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑及木果楝內酯化合物Xylogranatin C、Xylocarpin H和Xylomexicanin A。后5組中藥物終濃度分別設為1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L；上述實驗各組藥物均用終濃度0.1% DMSO溶解。每組均設3個復孔，置于飽和濕度、37 ℃和5% CO2培養箱中培養48 h，于培養結束前4 h，各培養孔加入5 mg/ml四甲基偶氮唑藍(MTT)10 μl，酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值)，計算細胞生存率，細胞生存率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。實驗數據用Origin 7.0軟件進行處理，受試藥物對細胞增殖活性的濃度-效應曲線用Hill數學模型擬合，計算藥物的IC50值。

3 Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達變化將KT細胞接種于培養皿中，待細胞生長融合至60%~70%，分別加入終濃度為10 μmol/L的5-氟尿嘧啶、順鉑和Xylogranatin C的含0.1% DMSO的1640培養基，溶劑對照組加入終濃度為0.1% DMSO的1640培養基，培養細胞24 h，用PBS洗滌細胞后，胰酶消化細胞，離心收集細胞，加入蛋白裂解液，冰浴下超聲波處理5 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，100 ℃加熱3 min使蛋白質變性，取50 μg蛋白在SDSPAGE電泳下分離，分離膠為12%，濃縮膠為5%。根據預染的蛋白Marker指示，小心割取目標蛋白所在的區帶，電轉移至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉于室溫下搖動封閉1 h。Caspases-3兔多克隆抗體(1∶800)、Bax鼠多克隆抗體(1∶1 000)、p53鼠多克隆抗體(1∶1 000)稀釋液封閉4 °過夜，1×TBS洗膜15 min，3次，二抗稀釋液(抗鼠1∶20 000，抗兔1∶20 000)孵育20 min，再次洗膜后加入ECL試劑，反應5 min，用X線片曝光1~10 min后，顯影。

4 Caspase抑制劑在木果楝內酯化合物抑制人KT細胞增殖中作用 MTT方法同前，96孔培養板，每孔含1×104個細胞，實驗分組為：溶劑對照組、終濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的Xylogranatin C組，20 μmol/L的Caspase抑制劑Z-VAD-FMK與1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L Xylogranatin C共同孵育組，細胞生存率計算方法同前，比較給予Z-VAD-FMK前后KT細胞的生存率變化。

5 統計學處理 數據用-x±s表示；兩組間數據用t檢驗，多組間數據用單因素方差分析。應用SAS 6.12統計軟件進行統計學分析。

結 果

1 三種木果楝內酯化合物對KT細胞增殖抑制作用MTT結果顯示：與溶劑對照組(生長率為100%)相比，順鉑對KT細胞的增殖顯示了較強的抑制活性，IC50為6.61 μmol/L；Xylogranatin C對KT細胞的增殖亦顯示了較強的抑制作用，IC50為5.09 μmol/L，并呈現劑量依賴性；且10 μmol/L Xylogranatin C與順鉑相比具有相同的抑制作用，兩者相比無統計學差異(P＞0.05)；5-FU以及Xylocarpin H和Xylomexicanin A對KT增殖顯示較弱或不顯示抑制活性。見圖2。

圖 2 三種木果楝內酯化合物對KT細胞增殖的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effects of xylogranatins C, H and A on proliferation of KT cells

2 Xylogranatin C對KT細胞p53、Bax和Caspaes-3的上調作用 Weston結果顯示：Xylogranatin C作用KT細胞后，可上調細胞內p53、Bax和Caspaes-3蛋白的表達，與溶劑對照組相比，有統計學差異(P＜0.05)；順鉑作用KT細胞后，顯著上調細胞內的Bax和Caspaes-3蛋白表達，與溶劑對照組相比較，有統計學差異(P＜0.01)；Xylogranatin C組與順鉑組比較，Bax和Caspaes-3的蛋白表達低于順鉑組，且有統計學差異(P＜0.01)。見圖3。

圖 3 Xylogranatin C(10 μmol/L)對KT細胞增殖作用的分子機制Fig. 3 Molecular mechanism of xylogranatin C (10 μmol/L)underlying proliferation of KT cells

3 Caspase抑制劑減弱了Xylogranatin C的細胞毒性作用 使用1μmol/L、10μmol/L和100 μmol/L的Xylogranatin C處理KT細胞，KT細胞生存率分別為71.97%、39.91%和11.15%；使用20 μmol/L的Caspase抑制劑Z-VAD-FMK與1μmol/L、10μmol/L和100 μmol/L Xylogra-natin C共同孵育KT細胞后，細胞生存率分別上升為82.78%、46.27%和30.99%。見圖4。

圖 4 Z-VAD-FMK減弱Xylogranatin C對KT細胞增殖的作用Fig. 4 Role of Z-VAD-FMK in reversing the inhibitory effect of xylogranatin C on KT cells

討 論

乳腺癌患者預后與其是否發生轉移密切相關，一旦發生遠端轉移，如腦轉移、肝臟轉移、骨轉移等預后較差，生存期明顯下降，增加了臨床治療的困難[9]。此外，以腋窩淋巴結轉移為首發癥狀的隱性乳腺癌的發生呈增加趨勢[10]，目前針對乳腺癌，除手術切除原發灶外，化療、內分泌治療及分子靶向治療相結合在乳腺癌遠位轉移中的應用受到越來越多的關注[11-12]，但尋找高效低毒、價格低廉的抑制腫瘤轉移的天然植物藥物仍是目前醫藥學界一直研究的熱點，具有一定的臨床應用前景。

本實驗室前期實驗結果證實從楝科植物木果楝種子中提純的木果楝內酯Xylogranatin C化合物具有較強抑制人肺腫瘤細胞增殖活性的能力[13]，其是否具有抑制乳腺癌腫瘤細胞的增殖作用尚未研究。

本實驗首次選用從楝科植物木果楝種子中純化的三種木果楝內酯Xylocarpin H、Xylogranatin C和Xylomexicanin A為實驗對象，觀察了三種木果楝內酯對人乳腺癌腦轉移細胞增殖的抑制活性，實驗結果顯示Xylogranatin C對KT細胞增殖顯示較強的抑制活性，且與順鉑作用相當，而5-FU對KT細胞增殖的抑制作用不明顯。

在探究藥物抗腫瘤細胞的機制方面，能否引起腫瘤細胞凋亡已成為評價抗癌藥物的一項重要指標[14]。目前已知多條途徑誘導細胞凋亡，Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡調節網絡中起關鍵作用，Caspase 3被認為是Caspase級聯反應中最關鍵的效應蛋白酶；Bax是另一種促進凋亡因子，Bcl-2/Bax鑲嵌在線粒體膜上，調控凋亡誘導蛋白的釋放和線粒體功能；此外，p53對誘導和執行細胞死亡起重要作用[15]，p53非轉錄依賴性凋亡調控功能依賴于p53蛋白與Bcl-2蛋白超家族成員(Bak，Bax，Bcl-2)間的相互作用。因此本實驗觀察了與細胞凋亡相關蛋白因子p53、Bax、Caspase-3的蛋白表達變化。實驗研究發現，Xylogranatin C可明顯誘導KT細胞內的p53、Bax和Caspase-3蛋白表達上調，表明Xylogranatin C通過誘導KT細胞凋亡抑制了腫瘤細胞增殖。使用Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可以減弱Xylogranatin C的細胞毒性作用，提示Xylogranatin C可能通過激活Caspase通路誘導KT細胞凋亡發揮抗腫瘤細胞增殖的作用。

本實驗初步研究了木果楝內酯化合物抑制人乳腺癌腦轉移細胞增殖的分子機制，限于體外實驗的局限性，Xylogranatin C是否能夠應用于整體實驗抑制腫瘤增殖，以及其抗腫瘤細胞增殖的分子機制還需要進一步研究和完善。

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