光學(xué)比濁法與連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法監(jiān)測(cè)血小板聚集功能的比較

關(guān) 杰，任軍偉，朱 遠(yuǎn)，傅淑宏，白 潔，鄧新立，叢玉隆

解放軍總醫(yī)院 南樓檢驗(yàn)科，北京 100853

抗血小板治療是心血管病患者重要的治療方法，由于其治療后仍存在出血或再次血栓的問題，臨床實(shí)驗(yàn)室可以通過血小板功能監(jiān)測(cè)患者治療情況。血小板功能檢測(cè)有諸多方法，許多文獻(xiàn)對(duì)不同檢測(cè)方法與臨床預(yù)后的關(guān)系作了評(píng)價(jià)，其中，光學(xué)比濁法(light transmittance aggregometry，LTA)是受到廣泛認(rèn)可，甚至被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”的血小板功能檢測(cè)方法，但存在如操作繁雜、質(zhì)量控制難等問題[1-2]。血小板功能檢測(cè)儀PL-11應(yīng)用的連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法，是以庫爾特原理為基礎(chǔ)的新型血小板功能檢測(cè)方法，通過觀察誘聚劑引起血小板聚集前后全血中血小板數(shù)量的改變來評(píng)估血小板功能。目前對(duì)于它的研究較少。本研究比較LTA與PL-11連續(xù)血小板計(jì)數(shù)方法對(duì)血小板功能的監(jiān)測(cè)，評(píng)價(jià)PL-11連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法與LTA的相關(guān)性及其監(jiān)測(cè)血小板功能的價(jià)值。

對(duì)象和方法

1 對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組選擇本院2012年經(jīng)血管造影確診為冠脈疾病(coronary artery disease，CAD)的患者26例，且目前僅以氯吡格雷作為抗血小板藥物，服藥時(shí)間＞1個(gè)月。其中男性19例，女性7例，平均年齡(76.81±2.13)歲；排除使用其他影響血小板功能的藥物(如阿司匹林，非甾體類抗炎藥，噻氯匹定，雙嘧達(dá)莫)、處于缺血性血管事件中或有出血性疾病的患者。另征集45例本院健康成年受試者為對(duì)照組，其中男33名，女12名，平均年齡(23.53±1.84)歲；排除患有任何慢性或者急性疾病、正在服用已知對(duì)血小板功能有影響的藥物(包括非甾體類抗炎藥)、吸煙或懷孕者。所有受試者對(duì)于本課題均知情同意。

2 儀器與試劑 CRONO-LOG Model 700血小板聚集儀(美國(guó)CHRONO-LOG公司)及配套試劑(ADP，濃度1 mmol/L)；PL-11血小板功能分析儀(南京神州英諾華醫(yī)療科技有限公司)及配套試劑(ADP，濃度50 mmol/L)；真空采血管為美國(guó)B.D.公司的含3.2%枸櫞酸鹽抗凝管。

3 標(biāo)本采集 均于清晨使用3.2%枸櫞酸鹽抗凝真空管采集受試者肘靜脈血：3管/人，其中1管用于PL-11檢測(cè)，2管用于LTA檢測(cè)。標(biāo)本保存于37 ℃恒溫箱，2 h內(nèi)完成檢測(cè)；檢測(cè)前不能出現(xiàn)凝集。

4 血小板聚集實(shí)驗(yàn)(LTA) 兩管枸櫞酸鹽抗凝血分別經(jīng)800 r/min、5 min和4 000 r/min、8 min得到富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)和乏血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)后各取500 μl加至比色杯。使用CRONO-LOG血小板聚集儀檢測(cè)，以PPP為空白參照，5 μl濃度為1 mmol/L的ADP為誘聚劑加入至PRP(ADP最終濃度：10 μmmol/L)，PRP中透光度改變最大時(shí)得到血小板最大聚集率(max aggregation ratio，MAR)，以百分?jǐn)?shù)表示。

5 PL-11連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法 使用移液器吸取0.5 ml枸櫞酸鹽抗凝全血至PL-11檢測(cè)試管并開始自動(dòng)檢測(cè)。全血標(biāo)本經(jīng)兩次血小板基礎(chǔ)值計(jì)數(shù)后，儀器自動(dòng)加入40 μl濃度為50 mmol/L誘聚劑ADP(全血中最終濃度：4 mmol/L)，并連續(xù)間隔一定時(shí)間對(duì)血標(biāo)本中血小板計(jì)數(shù)，當(dāng)?shù)玫阶畹脱“逵?jì)數(shù)時(shí)結(jié)果自動(dòng)換算，以最大血小板聚集率表示，即{(初始血小板數(shù)－最低血小板數(shù))÷初始血小板數(shù)}×100%。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS13.0進(jìn)行分析，連續(xù)變量采用-x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組結(jié)果相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析，多組間定量資料比較采用方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪圖軟件使用Prism 5 for Window version 5.01。

結(jié) 果

1 兩種方法檢測(cè)血小板聚集率比較 經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，LTA、PL-11分別檢測(cè)健康志愿者和服藥患者時(shí)，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.000 1)；兩種方法健康志愿者血小板聚集率值均大于服藥患者組(表1)。在兩組受試者中，LTA所檢測(cè)的最大血小板聚集率范圍高于PL-11，見圖1。

表1 兩種方法檢測(cè)最大血小板聚集率比較Tab. 1 MAR detected by LTA and continuous platelet count with PL-11(%)

圖 1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩種方法檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 MAR detected by LTA and continuous platelet count with PL-11 in CAD patients and volunteers

2 兩種方法相關(guān)性分析 所有受試者中PL-11與LTA結(jié)果MAR存在明顯相關(guān)( r=0.766，P＜0.000 1)(圖2A)；在服藥患者組中，PL-11與LTA結(jié)果存在較好的相關(guān)性( r=0.616，P＜0.001)(圖2B)；在健康志愿者結(jié)果中，未發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法存在相關(guān)性( r=0.250，P=0.098)。

3 PL-11檢測(cè)平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)的變化 結(jié)果顯示，兩組受試者全血標(biāo)本中加入誘聚劑ADP引起血小板聚集后，最大血小板聚集率主要出現(xiàn)在第3~5檢測(cè)點(diǎn)，MPV值也在第3點(diǎn)后出現(xiàn)最大值，二者變化趨勢(shì)一致。未發(fā)現(xiàn)健康者與患者初始MPV值的差異(P=0.321)；分別對(duì)兩組受試者前6個(gè)檢測(cè)點(diǎn)MPV進(jìn)行方差分析時(shí)(圖3)，第1、2個(gè)測(cè)試點(diǎn)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.998)，第3個(gè)測(cè)試點(diǎn)與第1、2個(gè)測(cè)試點(diǎn)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均＜0.000 1)，與第4、5、6測(cè)試點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.969，0.791，0.977)。

圖 2 PL-11與LTA相關(guān)性分析 A：所有受試者B：服藥患者組Fig. 2 Correlation between continuous platelet count with PL-11 and LTA in all subjects (A) and CAD patients (B)

圖 3 PL-11檢測(cè)血小板聚集時(shí)MPV變化 A：服藥患者組B：健康志愿者組Fig. 3 MPV detected by continuous platelet count with PL-11 in CAD patients (A) and volunteers (B)

討 論

自1962年血小板聚集功能的概念提出及20世紀(jì)80年代末英國(guó)血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(British com-mittee for Standards in Haematology，BCSH)提出血小板功能檢測(cè)方法指南后，許多實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法問世，其中最常用方法是LTA，被認(rèn)為是血小板功能檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”。盡管存在一些技術(shù)缺陷，仍有許多研究報(bào)道LTA檢測(cè)結(jié)果與臨床不良事件之間存在聯(lián)系[3-7]。

本文通過PL-11與LTA檢測(cè)健康人群及服用氯吡格雷患者經(jīng)ADP誘導(dǎo)后血小板聚集功能變化，對(duì)兩種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，證實(shí)PL-11連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法對(duì)全血標(biāo)本檢測(cè)與“金標(biāo)準(zhǔn)”的LTA方法在檢測(cè)血小板聚集功能時(shí)具有較好的相關(guān)性。由于兩種檢測(cè)方法均為體外檢測(cè)，受到采血、保存等因素的影響，二者檢測(cè)結(jié)果最大血小板聚集率在正常范圍內(nèi)微幅波動(dòng)，因此在健康人群中未見二者結(jié)果的相關(guān)性。

研究結(jié)果中LTA結(jié)果在健康人與服藥患者組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證實(shí)其能夠反映血小板功能及監(jiān)測(cè)服藥后血小板功能改變，與之前文獻(xiàn)結(jié)果一致[8-9]。PL-11連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法同樣能檢測(cè)到兩組受試者間差異。有文獻(xiàn)報(bào)道，同樣以血小板計(jì)數(shù)方法為基礎(chǔ)的Plateletworks儀器檢測(cè)到服用氯吡格雷后患者最大血小板聚集率也明顯降低[10]。當(dāng)以ADP為誘聚劑時(shí)，Van Werkum等[11]對(duì)CAD患者進(jìn)行檢測(cè)，Plateletworks與LTA之間結(jié)果存在較好相關(guān)( r=0.71，P＜0.000 1)，與本研究結(jié)果相近( r=0.766)。該作者認(rèn)為，通過血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)血小板聚集功能有時(shí)間依賴性，當(dāng)檢測(cè)時(shí)間＞10 min時(shí)結(jié)果偏低。事實(shí)上，加入ADP誘聚后，PL-11連續(xù)進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，在第3~5個(gè)測(cè)試點(diǎn)達(dá)到最大聚集率，時(shí)間為6~10 min，即血小板計(jì)數(shù)呈現(xiàn)先急劇減少而后緩慢增加的狀態(tài)，故10 min后結(jié)果偏低。這種現(xiàn)象同樣發(fā)生在LTA檢測(cè)中，透光強(qiáng)度急劇達(dá)到最大時(shí)又逐漸減小。這種現(xiàn)象可能與ADP濃度有關(guān)，因?yàn)楸驹囼?yàn)中所使用ADP濃度較低，有資料顯示，較低濃度的ADP刺激血小板聚集后易發(fā)生解聚，若提高濃度，可能使情況發(fā)生改變[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論在健康人或服藥患者中，LTA檢測(cè)結(jié)果范圍均高于PL-11。實(shí)際上LTA是誘聚劑刺激后，血小板與纖維蛋白原結(jié)合產(chǎn)生光學(xué)變化后的反映，而PL-11檢測(cè)的是經(jīng)庫爾特原理設(shè)定參數(shù)范圍內(nèi)認(rèn)為是血小板的較小顆粒(血小板直徑2~30 μm)，較LTA對(duì)小顆粒更敏感，故出現(xiàn)該現(xiàn)象。由此引起的問題可能是當(dāng)LTA測(cè)得最大血小板聚集率處于0~100%中間水平與較低水平時(shí)，PL-11結(jié)果變化較小，反映血小板功能較小差異時(shí)不明顯。不同檢測(cè)標(biāo)本可能也是帶來這種差異的原因，因?yàn)樵赑RP中可能存在由于離心從細(xì)胞中釋放出繼續(xù)引起血小板聚集的物質(zhì)[13]。這種推論需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

MPV被認(rèn)為是血小板活性的標(biāo)記物之一，增大的MPV提示血小板活性增強(qiáng)[14]。PL-11在連續(xù)計(jì)數(shù)血小板時(shí)，提供每個(gè)測(cè)試點(diǎn)的血小板MPV值，檢測(cè)結(jié)果中聚集后剩余血小板體積增加(其原因可能是兩個(gè)或者多個(gè)較小的血小板聚集成大血小板聚集顆粒引起)，為明確其活化聚集提供了依據(jù)。

綜上所述，PL-11連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法與光學(xué)比濁法在檢測(cè)血小板聚集功能時(shí)有較好的相關(guān)性，較全面地提供了最大血小板聚集率、血小板計(jì)數(shù)、MPV變化情況，是一種可以供臨床實(shí)驗(yàn)室選擇的血小板功能檢測(cè)方法。

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