染色體熒光原位雜交快速產前診斷染色體數目異常

姜淑芳，盧彥平，付玉榮，汪淑娟，張立文，李亞里，高志英

解放軍總醫院 婦產科，北京 100853

產前診斷(prenatal diagnosis)染色體病是降低胎兒出生缺陷，提高人口素質的重要措施之一。目前，約80%的產前染色體核型分析都是因唐氏綜合征篩查高風險而進行的[1]，細胞培養及染色體核型分析是確診染色體病的重要手段，被譽為診斷染色體病的金標準。但由于需較長時間細胞培養，報告結果所需時間較長，孕婦易產生焦慮情緒；有時因為細胞培養失敗、核型少或染色體分散差而不能得出分析結果。同時，染色體核型分析可以發現目標疾病以外的染色體異常，特別是某些并無明顯臨床表型改變的染色體結構異常，從而使產前咨詢變得更加繁雜。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術是20世紀80年代中期發展起來的非放射性原位雜交技術。其原理是將熒光素標記的探針與變性后的染色體、細胞、組織中的核酸按照堿基互補原則進行雜交，經洗滌后直接檢測或通過免疫熒光系統檢測，最后在熒光顯微鏡下觀察，不同的探針標記的熒光素顏色不同，從而可以在熒光顯微鏡下加以區分。由于產前診斷中80%以上與臨床相關的染色體異常是常見的染色體非整倍體異常[2]，因此針對這幾種染色體的FISH技術逐步應用于臨床產前診斷中。但是，該技術在產前診斷中如何應用，國內外一直有不同的觀點[1,3-4]。本研究分析比較494例羊水或臍帶血樣本的產前診斷結果，探討染色體熒光原位雜交及其聯合核型分析在產前診斷常見染色體異常中的應用價值。

資料和方法

1 臨床資料 2010年4月-2012年8月來我院產科門診進行產前診斷的孕婦494例，年齡19~48歲(平均33.6歲)，孕周15+1~34周(平均20+4周)，均為中孕期母血清篩查結果顯示高危、晚孕期超聲發現異常、高齡或其他產前診斷指征者，經詳盡的產前咨詢，簽署知情同意書后，實施羊膜腔穿刺或臍靜脈穿刺。

2 標本采集 在超聲引導下行常規穿刺術，抽取羊水或臍血。最先抽出的約2 ml羊水棄掉，再抽取羊水25 ml，無菌條件下注入3支尖底離心管中，每支分別為10 ml、10 ml、5 ml，分別用于細胞培養和FISH。臍血樣本約2 ml，分兩管，肝素抗凝。所有羊水和臍血樣本及時送檢，及時處理。

3 細胞培養及染色體核型分析 按照產前診斷技術行業標準和規范[5-6]，將兩管各約10 ml的羊水樣本，離心2 500 r/min，10 min，棄上清液，每管留沉渣約0.5 ml，分別加Gibco羊水培養基4 ml，吹沖混勻后接種2瓶細胞培養瓶中，分別置37 ℃、5% CO2孵箱中獨立培養，根據細胞生長狀況進行換液，并將上清液合并至一新培養瓶中，三瓶細胞繼續培養適當時間。按原位方法收獲細胞，經老化、顯帶、染色等處理后進行染色體核型分析。計數15個細胞染色體數目，分析3~5個克隆的染色體，每個克隆分析配對一個分裂相，并保存核型圖。臍帶血染色體核型分析同常規外周血操作，計數20個分裂相，選擇2~3個進行分析配對并保存。

4 熒光染色體原位雜交 參照試劑盒說明書和分子細胞遺傳學技術與應用指南[7]進行操作。將約5 ml羊水細胞樣本置于15ml尖底離心管中，1 200 r/min，離心10 min，去上清，加入5 ml預熱至37 ℃的氯化鉀(KCl)溶液進行低滲處理。臍血樣本0.5 ml直接加入5 ml預熱至37 ℃的KCl溶液進行低滲處理。再經固定液(甲醇∶冰醋酸，3∶1)固定后制成細胞膜片，經消化后，用GLP 13/GLP 21組和CSP18/ CSP X/ CSP Y組探針進行雜交，再經洗滌與復染后，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10~20 min后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾光片組觀察細胞數量和分布，隨機計數至少50個細胞的雜交信號，90%以上的細胞顯示GLP 13/GLP 21組：21號染色體為2個紅色熒光點，13號染色體2個綠色熒光點；CSP18/ CSP X/ CSP Y探針組：18號染色體為2個天藍色熒光點，若X顯示2個綠色熒光點，為女性；X顯示1個綠色熒光點，Y顯示1個紅色熒光點，為男性；均視為未見異常。60%以上的細胞出現異常信號，多或者是少，則判斷為相應的染色體數目異常。必要時，可增加計數細胞數，甚至瀏覽全片。

結 果

1 羊水或臍血樣本的染色體核型分析 結果報告時間平均為4~5周，分析成功率為99.60%(492/494)；染色體異常發生率為8.74%(43/492)；數目異常占異常總數的81.40%(35/43)，結構異常占18.60%(8/43)。在數目異常中，21三體占74.29%(26/35)，18三體17.14%(6/35)，性染色體數目異常8.57%(3/35)。見表1。

2 染色體熒光原位雜交檢測結果 報告時間平均為72~96 h，分析成功率為100%(494/494)，染色體異常發生率為7.09%(35/494)，均為數目異常(表1)，其中21三體(見圖1A)占數目異常的74.29%(26/35)，18三體(見圖1B)17.14%(6/35)，性染色體數目異常(見圖1C、D、E)8.57%(3/35)。

3 熒光染色體原位雜交與核型分析檢測常見染色體數目異常比較 FISH能夠檢測出所有的21、18和性染色體的數目異常，與染色體核型分析方法相比，結果完全相符。見表2。

表1 染色體核型分析和FISH檢測結果Tab.1 Findings in chromosome karyotype analysis and FISH

圖 1 FISH檢測染色體數目異常 A： 21三體； B: 18三體； C： XXY； D： XYY； E： XOFig. 1 FISH showing abnormal chromosomes A: trisome 21; B: trisome 18; C: XXY; D: XYY; E: XO

表2 熒光染色體原位雜交與核型分析檢測結果比較Tab. 2 Findings in FISH and chromosome karyotype analysis

討 論

許多研究證明，利用18、X、Y染色體的著絲粒α衛星探針和13、21染色體的特異序列探針快速檢測羊水細胞中13、18、21、X和Y染色體的數目異常，進行產前診斷是快捷有效的，可減輕等待分析結果給孕婦帶來的焦慮情緒。該技術的檢測敏感性和特異性分別為83%~100%和99.8%~100%[8]，被譽為快速核型分析技術(rapid aneuploidy detection，RAD)，隨著探針的商品化和認證，FISH在產前診斷中逐步開始應用。但是，關于如何應用，國內外一直有不同意見，歸納為四種[9]：一是單獨只用染色體核型分析；二是RAD聯合染色體核型分析；三是讓孕婦自行選擇RAD或染色體核型分析；四是只用RAD。2000年，美國醫學遺傳學學院和美國人類遺傳學會發表聲明，認為間期核FISH技術對產前診斷和篩查染色體異常有高敏感性和準確性，可提供非常準確的結果。陽性FISH結果具有診斷參考價值。胎兒臨床管理的最終決定需依據以下三個條件中的任意兩條：陽性FISH結果、確定的染色體分析結果或一致的臨床信息。在臨床診療實踐中，有學者報道[10]，72%的胎兒染色體異常的孕婦選擇了根據FISH結果和超聲檢查結果引產，而沒有等待核型分析結果。2004年，英國國家篩檢委員會(UK National Screening Committee，UKNSC)則推薦，針對唐氏綜合征產前篩選檢查結果高風險或高齡、超聲顯示胎兒結構正常的孕婦，可以采用FISH等快速診斷方法直接進行產前診斷。

目前，國內已有常見非整倍體異常的商品化探針，許多實驗室具備了所需設備，熟練掌握了操作技術，因此，間期核FISH應用于臨床產前診斷，已較為普及。本研究中，FISH能夠檢測出所有的21、18和性染色體的數目異常(占異常總數的81.40%)，與染色體核型分析方法相比，結果完全相符。與Neagos等[11]研究結果是一致的。但是，由于FISH技術本身固有的技術局限性，只能檢測探針對應的染色體異常，而未能檢測出8例結構異常。目前的產前篩查目標疾病主要是21三體、18三體、13三體和開放性神經管缺陷，其中，開放性神經管缺陷主要依賴于超聲檢查。因此，可以認為，針對常見染色體異常(13、18、21、X、Y的非整倍體異常)，間期核快速FISH可直接單獨應用于產前診斷，既簡便、快速，又避免了因為染色體核型分析發現的部分無明顯表型改變的結構異常。在染色體異常率高發的情況下，如超聲顯示胎兒結構異常、高齡、父母為染色體異常攜帶者等，FISH應與傳統的染色體核型分析相結合，一方面利用FISH快速檢測常見染色體異常，提高分析的速度和效率，減輕孕婦的精神負擔，同時應用經典的染色體核型分析技術保證檢測結果的全面、準確、可靠。

在產前診斷中，染色體嵌合體問題也是備受關注的問題。FISH能夠檢出部分嵌合體。而某些嵌合體，特別是低比例的嵌合體，難以檢測出來，而這種低比例的嵌合體存在的意義值得臨床探討，特別是超聲顯示胎兒結構正常時，染色體嵌合體的問題更是產前咨詢中的棘手問題。而在臨床實踐中，羊水細胞染色體核型分析提示的嵌合體，經臍血細胞核型分析復檢為正常的例子也屢見不鮮。趙欣榮等[12]發現，羊水細胞染色體核型分析為46，XY[42]/47，XY，+8[12]的嵌合體，經臍血細胞核型分析復檢為正常，由于孕婦為高齡，超聲檢查胎兒正常，經遺傳咨詢后，孕婦要求繼續妊娠。因此在為孕婦進行產前診斷時，詳盡的咨詢工作十分重要。無論是選擇FISH，還是FISH聯合細胞染色體核型分析檢查，在咨詢時，都要充分告知技術的優越性和局限性，而對于檢驗結果的解讀也是重要的產前診斷環節。

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10 Bryndorf T， Lundsteen C， Lamb A， et al. Rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidies by interphase fluorescence in situ hybridization： a one-year clinical experience with high-risk and urgent fetal and postnatal samples［J］. Acta Obstet Gynecol Scand，2000， 79（1）： 8-14.

11 Neagos D， Cretu R， Sfetea RC， et al. The importance of screening and prenatal diagnosis in the identification of the numerical chromosomal abnormalities［J］. Maedica（Buchar）， 2011，6（3）：179-184.

12 趙欣榮，吳怡，韓旭，等．熒光原位雜交產前診斷染色體異常的臨床應用［J］.中國優生與遺傳雜志，2012，20（5）：46-47.