Ezrin與 MMP2在結腸癌組織中的表達及意義

程 開,吳雯婷,董慧慧

(佳木斯大學附屬第一醫院消化內科,黑龍江 佳木斯 154003)

結腸癌(carcinoma of colon)是結腸黏膜上皮和腺體發生的惡性腫瘤[1]。近年來大腸癌的發病率與死亡率有逐年上升的趨勢[2]。腫瘤轉移是結腸癌高死亡率的主要原因[3]。相關研究已證實,埃茲蛋白(Ezrin)與基質金屬蛋白酶2(MMP2)在腫瘤細胞侵襲轉移過程中,參與并促進了許多重要步驟,包括:細胞骨架結構的重構,細胞表面結構的抗原識別,改變細胞間黏附力,促進新血管形成,影響腫瘤細胞與免疫細胞間的作用。Ezrin蛋白與 MMP-2在促進結腸癌細胞浸潤轉移中的作用聯合研究,國內外尚未見報道。本實驗利用免疫組化法檢測正常結腸組織及結腸癌組織中兩蛋白含量,探討兩蛋白在結腸癌轉移中的相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

鼠抗人 Ezrin單克隆抗體,鼠抗人 MMP2單克隆抗體,免疫組化 SP檢測試劑盒,DAB顯色試劑盒,EDT A抗原修復液,PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑),粉劑型抗原修復液(檸檬酸法 ),多聚酶結合物 ,放大劑 (鼠 /兔 ),LEICA RM1020脫水機 ,ShanDoN Histocentre 3(包埋機 ),LEICA RM 2235切片機,LEICA HI1220烘片機,LEICA HI1210攤片機,電壓力煲,照相顯微鏡。

1.2 方法

①留取自2011-01～ 2012-06佳木斯大學附屬第一醫院結腸癌手術標本 48例,對以上48例標本留取切端組織 (作為正常組織標本)。術后立即取材,每例留取標本大小約1.0cm×1.0cm×1.0cm。②取好的組織塊放入脫水機,依次經過甲醛,由低到高梯度酒精脫水,二甲苯及石蠟固定包埋。③冰凍組織蠟塊后經切片、展片、烤片制成片子。④切片經二甲苯,脫蠟,二甲苯,由高到低梯度酒精,蒸餾水沖洗,PBS液洗3次。⑤高溫修復法修復組織抗原,PBS液洗片3次。⑥滴加一抗 50μL,4℃冰箱內過夜,PBS液洗片3次。⑦滴加放大劑50 μL,室溫靜置 10min,滴加多聚酶結合物 50 μL,室溫靜置1h,PBS液洗片3次。⑧滴加顯色劑 DAB,蘇木精復染2min,鹽酸酒精分化,氨水返藍 ,由低到高濃度梯度酒精,二甲苯,最后封片,鏡檢。

1.3 染色結果判定

Ezrin蛋白以胞漿呈棕黃色染色為陽性,MMP-2蛋白主要以胞膜呈棕黃色為陽性,可有少量胞漿棕黃色染色,且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。以每張切片中陽性細胞占全部癌細胞的比例計算,每高倍鏡隨機選取5個視野計數,完全陰性或陽性率 ＜5%為陰性 (-);其余記為陽性(+)。

1.4 統計學處理

對數據進行整理 ,采用 SPSS Statistics17.0統計軟件進行分析,本試驗數據資料為定性資料,對組間差異選用卡方檢驗,相關性選用相關分析,設定 P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 Ezrin蛋白組免疫組化結果

結腸癌組織與正常結腸組織對比,Ezrin的表達有顯著差異,有統計學意義 (P ＜0.01,i2= 45.511)。在結腸癌組織中 ,Ezrin的表達,與性別、年齡、分化程度無關,無統計學意義 (P值分別為0.412、0.650、0.782,均 ＞ 0.05);與有無淋巴結轉移、不同 Duke’s病理分期有顯著差異,有統計學意義(P值分別為 0.007、0.026,均 ＜ 0.05)。

2.2 MMP2蛋白組免疫組化結果

結腸癌組織與正常結腸組織對比,MMP2的表達有顯著差異,有統計學意義 (P ＜0.01,i2= 43.344)。在結腸癌組織中,MMP2的表達 ,與性別、年齡、分化程度無關,無統計學意義 (P值分別為0.184、0.051、0.118,均 ＞ 0.05);與有無淋巴結轉移、不同 Duke’s病理分期有顯著差異,有統計學意義(P值分別為 0.017、0.039,均 ＜ 0.05)。

2.3 Ezrin蛋白與 MMP-2蛋白相關性分析

48例結腸癌組織中 Ezrin與 MMP2兩者表達均陰性的有 5例,均陽性的有27例 ,Ezrin陽性同時 MMP2陰性的有 7例,Ezrin陰性同時 MMP2陽性的有 9例。Ezrin蛋白與 M MP-2蛋白無相關性 (P= 1.210,R= 0.159,P＞ 0.05)。

3 討論

埃茲蛋白作為膜骨架連接蛋白,是這一龐大反應體系中,促進腫瘤細胞浸潤轉移的重要成員之一。在正常細胞中,Ezrin蛋白一面以 N端高度保守的 FERM域結構與細胞膜整合蛋白胞內面直接相連,或通過與膜周蛋白 EBP-50的PDZ結構域結合間接連接膜整合蛋白;另一面以 C端 actin結合位點與細胞骨架中絲狀肌動蛋白[4]相連;而連接 N端與C端的中央區是α螺旋結構。正是由于埃茲蛋白這一特異分子空間結構,才賦予其重要的生理功能,即維持細胞正常形態,參與細胞內外物質轉移及信號轉導,參與細胞的生存及死亡。在 Ezrin的蛋白分子鏈上,存在多個功能位點,如:絲氨酸殘基,酪氨酸殘基,賴氨酸殘基,蘇氨酸殘基[5];每種殘基又有多個存在位點。這些殘基都可通過復雜的機制被激活,使埃茲蛋白構象呈開放狀態,促進各種細胞膜運動,影響膜整合蛋白粘附功能,通過影響多條信號轉導通路間接參與腫瘤細胞的遷移。現發現的埃茲蛋白可直接或間接影響的細胞信號轉導途徑包括:Rho信號轉導途徑[6],賴氨酸受體信號轉導途徑,PKA信號轉導途徑,M APK信號轉導途徑[7],PI3K/AKT信號轉導途徑,APO1/Fas介導的細胞凋亡途徑。

基質金屬蛋白酶-2是 MMPs(基質金屬蛋白酶家族)中重要成員之一。MMP-2屬于明膠酶類的一種,主要酶解細胞外基質和基底膜中的Ⅳ型膠原和明膠。在正常情況下,MMP-2與基質金屬蛋白酶抑制劑(TIM P)共同存在,并以一定比例始終保持著某種動態平衡,共同維持著細胞外基質新陳代謝的正常有序地進行,并保持著基底膜的完整性。當腫瘤微環境存在時,腫瘤細胞自身也合成并分泌基質金屬蛋白酶,酶原形式的基質金屬蛋白酶2,通過一些相關的信號轉導通路的激活后 ,成為活化狀態,活化的 MMP-2可與基底膜上受體結合,促進蛋白水解酶的激活及釋放,這樣細胞外基質中的 M MP-2相對于 TIM P-2過多,導致 ECM中明膠過度降解,BM的完整性破壞。腫瘤細胞這是就可利用細胞外基質及基底膜中的破損區域做定向運動,突破這道天然免疫防線基底膜,遷徙到腫瘤周圍組織,還可進一步破壞血管的壁,利于腫瘤細胞和 MMP-2自身隨血液循環到達遠處形成轉移灶。

從本實驗研究結果看,Ezrin蛋白和 MMP-2在腫瘤細胞的浸潤轉移中都有促進作用,但 Ezrin與 MMP-2無相關性。二者在促進腫瘤細胞遷徙,擴散過程中,都通過多種方式,多種途徑直接或間接促進、參與、影響腫瘤轉移 ,其中都通過影響細胞膜上黏附分子起作用。埃茲蛋白在胞內對黏附分子作用,基質金屬蛋白酶在胞外影響細胞黏附分子,從本實驗結果兩者無相關性推測,二者在影響黏附分子過程中,并不存在共同途徑,而是通過各自不同的方式途徑影響腫瘤細胞黏附性,促進腫瘤細胞浸潤于轉移的。二者各自影響腫瘤細胞黏附性的途徑及機制尚不清楚,有待國內外相關學者的共同努力,深入研究。

圖1 結腸癌組織中 Ezrin蛋白免疫組化染色(400倍)胞漿染色

圖2 結腸癌組織中 M MP2蛋白免疫組織染色(400倍)胞膜染色

[1]李玉林,唐建武.病理學 [M].第6版.北京:人民衛生出版社,2003,217

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