胃癌組織中 NF-κ B、P73表達(dá)與幽門(mén)螺旋桿菌感染的相關(guān)性研究

魏微微,王亞洲,孟凡石

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154003)

目前幽門(mén)螺旋桿菌被公認(rèn)感染是可以增加細(xì)胞的增殖活性,并且通過(guò)使其抑癌基因失活及其癌基因激活從而使胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生癌變。在胃癌機(jī)制分子生物學(xué)水平上,核因子κB(nuclear factor kappa B,N F-κ B)是一類具有和某些基因上啟動(dòng)因子區(qū)固頂核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能性蛋白質(zhì),因此諸多因素可以使 NF-κB促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng),導(dǎo)致某些控制細(xì)胞轉(zhuǎn)化靶基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),并且誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。王維[1,2]等所應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)檢測(cè)了有41例胃癌和25例相應(yīng)非癌組織中 NF-κ B的表發(fā)達(dá),而正常顯示無(wú)論是胃黏膜還是腸型化生以及不典型增生和胃癌組織中,陽(yáng)性率逐漸升高 ,同時(shí)在低分化期、進(jìn)展期、還有有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)至漿膜的胃癌組織中,增高尤為明顯。而P73蛋白是在1997年發(fā)現(xiàn)的和 P53具有十分相似的結(jié)構(gòu)和功能的新基因,近年來(lái)研究表明 P73在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等方面起重要作用,國(guó)內(nèi)國(guó)外研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),進(jìn)一步分析P73的過(guò)表達(dá)與胃癌臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系有所發(fā)現(xiàn),由于腫瘤體積增大,浸潤(rùn)深度增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,P73mRN A表達(dá)有越加增高趨勢(shì)。許許多多的資料表明 ,NF-κ B、P73與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移以及腫瘤耐藥問(wèn)題有著緊密的相關(guān)。對(duì)于 Hp與 N F-κB、P73表達(dá)兩者之間的相關(guān)性研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究,進(jìn)一步探討 Hp感染誘發(fā)胃癌發(fā)生的機(jī)制,并進(jìn)一步研究?jī)烧咴谖赴┌l(fā)生發(fā)展中的作用和意義及其與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象及分組

選取 2012-01～ 2013-03佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科胃癌手術(shù)住院病人100例 ,其中男60例,女40例。入選條件:①年齡 30～ 85歲;②術(shù)前未經(jīng)過(guò)化療、放療、生物治療;③所有病例均采用:標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù),標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù)是胃切除范圍為全胃2/3以上,淋巴結(jié)清除范圍為 D2的清除術(shù) ,適應(yīng)證是T1中直徑 ＞ 2.1cm、N1(+ )和原發(fā)癌為 T2～ T3、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為 N0～N2(+)者,術(shù)前、術(shù)中檢查無(wú)腹膜轉(zhuǎn)移與肝轉(zhuǎn)移,進(jìn)行 D2清除術(shù)可獲 A級(jí) (絕對(duì) )B級(jí) (相對(duì) )根治術(shù)。所有病例均由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行印象觀察,并經(jīng)病理檢查證實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本經(jīng) 10%福爾馬林固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,選取染色較好的切片進(jìn)行病理復(fù)查及免疫組化檢測(cè)。臨床病理診斷為高分化腺癌;中分化腺癌;低分化腺癌;浸潤(rùn)出漿膜;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者;無(wú)轉(zhuǎn)移者。獲取癌旁正常組織,作為對(duì)照。

1.2.1 HP檢測(cè):Warthin- Starry銀染法觀察 HP感染情況。

1.2.2 P73,N F-κ B的檢測(cè):SupervisionTM二步法免疫組化染色。

1.2.3 結(jié)果判定

(1)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):HP感染:Warthin-Starry銀染法觀察 Hp感染情況,若有 Hp感染為棕黑色。

N F-κB判定標(biāo)準(zhǔn):NF-κ Bp65以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒狀沉淀,染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者為陽(yáng)性。

P73判定標(biāo)準(zhǔn):P73染色陽(yáng)性信號(hào)為棕紅(褐)色,定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿,染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者為陽(yáng)性。

(2)結(jié)果分級(jí):HP感染結(jié)果分級(jí):W-S染色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí):未見(jiàn)細(xì)菌;1級(jí):偶有細(xì)菌;2級(jí)細(xì)菌數(shù)目介于1級(jí)和 3級(jí)之間;3級(jí):所有視野內(nèi)見(jiàn)大量細(xì)菌。

NF-κB判定結(jié)果分級(jí):高倍鏡下取10個(gè)不同視野 ,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,取其平均值,按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率,并且結(jié)合染色強(qiáng)度分析。參照許良中等[3]制訂的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分,先將染色強(qiáng)度打分(A分):0分為無(wú)色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。然后將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分打分 (B分):0分為陰性,1分為陽(yáng)性細(xì)胞 ＜5%,2分為陽(yáng)性細(xì)胞在 5%～ 25%,3分為陽(yáng)性細(xì)胞在25%～50%,4為陽(yáng)性細(xì)胞＞50%。根據(jù)兩項(xiàng)指標(biāo)積分?jǐn)?shù) (積分=A×B)高低分為:0、1分為陰性(-),2、3分為 弱陽(yáng)性(±),4、 6分為陽(yáng)性 (+);8、9、12分()為強(qiáng)陽(yáng)性。以-和±為表達(dá)陰性(-),+和為表達(dá)陽(yáng)性(+ )。

P73判定結(jié)果分級(jí):參照文獻(xiàn)[4],每張切片都隨機(jī)選5個(gè)高倍視野 ,每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,觀察陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度,并且計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比,按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比進(jìn)行打分:可分為 0分為小于 5%,1分為 5%～25%,2分為25%～50%,3分為 50%～75%,4分為大于75%。根據(jù)其染色強(qiáng)度進(jìn)行打分:又可分為0分無(wú)色,1分淺黃色,2分棕黃色,3分棕褐色。染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)可分為:9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(),5～ 8分為陽(yáng)性(+ ),0～4分為陰性(-)。為了方便于統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行分析,強(qiáng)陽(yáng)性和陽(yáng)性合并成為陽(yáng)性一組。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 主要試劑

幽門(mén)螺旋桿菌快速尿素酶試紙購(gòu)于珠海克迪公司;FHIT多克隆抗體(一抗)購(gòu)于英國(guó) Abcam公司;P73鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于北京中杉公司;NF-κBp65鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于北京中杉公司;免疫組化 PV-9000試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 主要儀器

全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)沈陽(yáng)市龍首電子儀器有限公司;石蠟包埋機(jī)、冷凍臺(tái)、攤片機(jī)、烤片機(jī)均為孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司;石蠟切片德國(guó) Microm公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用卡方檢驗(yàn)方法,Fisher精確概率法及 Spearman等級(jí)相關(guān)對(duì)相應(yīng)資料進(jìn)行分析,取0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者 HP感染情況

Warthin-Starry銀染法觀察胃癌患者的 Hp感染情況,若出現(xiàn)棕黑色則有 HP感染,該患者列為 HP感染組,相反,為 HP感染組;兩組患者進(jìn)行卡方檢驗(yàn) (i2= 1.07,P＞ 0.05),胃癌組織中 HP感染率為66.00%,癌旁正常組織作為對(duì)照組,癌旁組織的 HP感染率21.31%,見(jiàn)表 1。

表1 胃癌患者 HP感染情況

2.2 胃癌患者 NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況

N F-κ Bp65蛋白在胃癌組織中(HP感染組和非 HP感染組之和)的表達(dá)陽(yáng)性率為52.39%,癌旁組織(對(duì)照組 )的表達(dá)率為4.00%,正常胃黏膜中未檢出 NF-κBp65蛋白,HP感染組患者 NF-κ Bp65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為31.81%,非 HP感染組患者 NF-κ Bp65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為20.58%。HP感染組、非 HP感染組和對(duì)照組的 P73蛋白表達(dá)情況(i2= 13.77,P ＜ 0.05),見(jiàn)表 2。

表2 胃癌患者 NF-κBp65蛋白表達(dá)情況

2.3 胃癌患者 P73蛋白的表達(dá)情況

P73蛋白在胃癌組織中(HP感染組和非 HP感染組之和 )的表達(dá)陽(yáng)性率為52.50%,癌旁組織(對(duì)照組)的表達(dá)率為0%,正常胃黏膜中未檢出 P73蛋白,HP感染組患者 P73蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為34.85%,非 HP感染組患者 P73蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為17.65%。HP感染組、非 HP感染組和對(duì)照組的 P73蛋白表達(dá)情況 (i2= 22.23,P＜0.05),見(jiàn)表3。

表3 胃癌患者 P73蛋白表達(dá)情況

3 討論

胃癌是消化道系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一,是占居我國(guó)癌發(fā)病和死亡率最高的[5],而且是逐年上升不斷的增長(zhǎng)趨勢(shì),對(duì)胃癌研究已經(jīng)深人到多種基因突變和蛋白分子表達(dá)。癌細(xì)胞分裂增殖越旺盛,以致胃癌的惡性生長(zhǎng)和浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移越快。

幽門(mén)螺桿菌是全世界范圍乃至全球相對(duì)比較高感染率的慢性感染性致病菌之一,全世界以有50%之上的人口感染HP,據(jù)資料顯示,HP的感染率達(dá)為40%～80%為慢性胃炎患者,而且在慢性活動(dòng)性胃炎患者中可達(dá)90%以上為幽門(mén)螺桿菌感染,胃潰瘍患者感染率也可達(dá)60%～100%,胃癌患者的感染率則為43%～78%。胃部疾病的發(fā)生、發(fā)展都跟幽門(mén)螺桿菌的感染有著密相關(guān),并且其中大量 HP是誘發(fā)胃癌形成的重要危險(xiǎn)因素[6]本研次究結(jié)果顯示各組 HP感染率分別為:胃癌組織中 HP感染率 66.00%,癌旁組織 HP感染率為21.31%,正常胃黏膜無(wú) HP感染。

3.1 NF-κ Bp與胃癌發(fā)生的關(guān)系

核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κ B的失控而導(dǎo)致的,N F-κB在腫瘤中的異常激活可能是腫瘤細(xì)胞抗凋亡的主要途徑之一[8,9,15]。同時(shí) N F-κ B還通過(guò)非凋亡的形式來(lái)促進(jìn)腫瘤的形成:即也可通過(guò)激活原癌基因 c-myc及 cyclinD1直接刺激增生。HinzM等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),核轉(zhuǎn)錄因子 N F-κ B的靶基因是細(xì)胞周期素 cyclinD1,cyclinD1的轉(zhuǎn)錄可被 N F-κ B啟動(dòng) ,可使 Gl/G向 S期過(guò)渡,以致細(xì)胞增殖,最終使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化、癌變。

實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中,N F-κ Bp65在52例中有 HP感染胃癌患者中陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)到為 31.81%,N F-κ Bp65在無(wú) HP感染胃癌患者中陽(yáng)性表達(dá)率為20.58%,N F-κ Bp65在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為4.00%,而正常胃黏膜中 N F-κ Bp65均為陰性。有 HP感染和無(wú) HP感染胃癌患者的 N F-κ Bp65表達(dá)陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05),且 HP感染組的 N F-κBp65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于無(wú) HP感染組,提示胃癌患者的N F-κ Bp65蛋白表達(dá)與 HP感染存在相關(guān)性,即有 HP感染,N F-κ Bp65蛋白的表達(dá)會(huì)增高。HP感染組、無(wú) HP感染組及對(duì)照組(癌旁正常組織)的 NF-κ Bp65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05),且 HP感染組和無(wú) HP感染組的N F-κ Bp65蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組 ,提示 N F-κ Bp65蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率比較高的,且陽(yáng)性表達(dá)隨著腫瘤的惡性程度呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。

3.2 P53基因與胃癌發(fā)生的關(guān)系

具有“分子警察基因”和“凋亡基因”之稱的基因是 P53基因。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道大約50%的人類腫瘤中缺乏野生型P53,所以免疫組化方法檢出的 P53蛋白均屬于突變型[14]。應(yīng)用免疫組化方法可以檢測(cè)出 P53蛋白的異常表達(dá),同時(shí)反映出 P53突變蛋白在核內(nèi)的積累。最近幾年來(lái)應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)證實(shí) P53蛋白在胃癌組織中有過(guò)度的表達(dá),本篇文章采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)的100例胃癌組織標(biāo)本,P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為52.50%,低于國(guó)內(nèi)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中的水平。經(jīng)過(guò)本研究檢測(cè)到的 P53蛋白陽(yáng)性反應(yīng)物全部都為癌變細(xì)胞,鄰近的間質(zhì)及相應(yīng)正常黏膜上皮均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá),這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道相一致。HP感染組、非 HP感染組和對(duì)照組P73蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),說(shuō)明胃癌患者 P73蛋白表達(dá)與 HP感染存在相關(guān)性,目前,對(duì)胃癌患者 P73蛋白表達(dá)與 HP感染存在之間的關(guān)系研究尚不明確,仍有待于進(jìn)一步研究。

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