曲美他嗪后處理與缺血后處理對大鼠再灌注心肌保護作用的對比

阮圣斐 周大亮 趙學忠 睢大員 于小風 曲紹春 江一川

(吉林大學第一醫院心血管疾病診治中心，吉林 長春 130021)

心肌缺血再灌注損傷是在各種原因導致心肌血液灌注量減少引起心肌缺血性損傷的基礎上，恢復血流后缺血性損傷進一步加重，甚至出現不可逆性損傷的現象。2003年，Zhao等〔1〕提出缺血后處理的概念后，大量的臨床實驗已經證實后處理可減輕再灌注損傷〔2〕。近年來人們發現在心肌再灌注開始時應用某些藥物進行后處理也可以實現相似的效果〔3〕。本實驗嘗試應用曲美他嗪(TMZ)進行藥物后處理，并對比觀察曲美他嗪后處理和缺血后處理對心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性、清潔Wistar大鼠40只，體重230～270 g，合格證號:SCXK-(吉)2003-0001，購自吉林大學動物實驗中心。

1.2 試劑及儀器 BX51光學顯微鏡(日本 Olympus);JEM-1200EX型透射電子顯微鏡(日本);RM-2145型石蠟切片機(徠卡公司);DR-HW-1電熱恒溫水溫箱(北京西城區醫療器械廠);COBAS-FARA自動生化分析儀(瑞士Roche公司);曲美他嗪片劑(法國施維雅公司)。

1.3 實驗分組及給藥 將40只Wistar大鼠按體重隨機分為假手術組、模型組、曲美他嗪組、缺血后處理組。假手術組只開胸心臟穿針但不結扎;心肌缺血再灌注模型參照文獻〔4〕方法稍加改進，開胸結扎前降支，造成缺血30 min后，松開絲線恢復冠狀動脈血流，再灌注120 min;曲美他嗪組于再灌注前60 min灌胃曲美他嗪10 mg/kg，使再灌注時血藥濃度達峰值;缺血后處理組缺血30 min后解開絲線再灌注30 s、再結扎30 s，循環3次后持續再灌注120 min。

1.4 梗死面積測量 每組取5只大鼠取血后剖取心臟，用生理鹽水洗凈心腔內積血，去掉心房組織及脂肪，稱重，將左心室心肌橫切4～5片，然后浸入氯化硝基四氮唑藍(NB-T)磷酸緩沖液中，置37℃恒溫水浴，待染色完全后取出，正常組織染色，缺血組織不染色。切下缺血心肌稱重，用缺血心肌與左心室濕重的百分比計算梗死面積。

1.5 心肌細胞形態學觀察 其余5只大鼠取血后剖取心臟，取心尖相應心肌組織制備成1 mm3標本，置入2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定液中，備電鏡采集圖像。同時將余下左心室環切塊，10%中性甲醛緩沖液中固定，備HE染色、鏡檢并采集組織圖像。

1.6 血清心肌酶測定 各大鼠自腹主動脈取血2～3 ml置于離心管，靜置 30 min，離心12 min(4℃，3 000 r/min)，取上清液以COBAS-FARA自動生化分析儀檢測血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉氨酶(AST)活性。

1.7 統計學處理 實驗數據以x±s表示，采用組間比較t檢驗進行統計分析。

2 結果

2.1 曲美他嗪后處理對心肌梗死面積的影響 假手術組未見缺血及梗死區，曲美他嗪組〔(12.73±2.0)%〕與缺血后處理組〔(11.76±3.1)%〕差異無統計學意義(P＞0.05)，兩組與模型組〔(18.42±4.1)%〕比較差異顯著(P＜0.05)。

2.2 曲美他嗪對心肌組織形態學的影響 HE染色光鏡下顯示:假手術組心肌細胞大小、結構正常，排列規則，細胞界限清晰;模型組心肌細胞腫脹，界限不清，間隙增大，心肌纖維間充滿大量紅細胞或中性粒細胞浸潤;曲美他嗪組與缺血后處理組的形態變化較模型組均有不同程度改善。見圖1。

2.3 曲美他嗪后處理對心肌細胞超微結構的影響 假手術組心肌細胞超微結構基本正常，其余各組均有不同程度損傷，以模型組損傷最為嚴重，曲美他嗪后處理及缺血后處理組損傷較輕。見圖2。

2.4 曲美他嗪后處理對心肌酶學的影響 與模型組相比，曲美他嗪組和缺血后處理組CK、LDH、AST活性均明顯降低(P＜0.05)，曲美他嗪組與缺血后處理組之間差異不顯著(P＞0.05)。見表1。

圖1 各組心肌組織形態學改變(HE，×100)

圖2 各組心肌組織超微結構(×25 k)

3 討論

心肌缺血再灌注損傷的概念1960年首次由Jennings等〔5〕提出，半個世紀以來，伴隨著臨床上PTCA、PCI、CABG等治療技術的廣泛應用，其危害越來越受到人們的關注。Zhao等〔1〕在結扎犬左冠狀動脈前降支60 min后，給予重復3次的30 s再灌/30 s缺血的循環，然后再恢復冠脈血流，觀測到心肌梗死面積減小，從而提出了缺血后處理的方案;隨后，大量的臨床實驗已經證實這種經典的后處理方法有明確的心臟保護作用〔2〕。故本實驗中采用這種經典的后處理方式建立缺血后處理組的模型。

近年來隨著對后處理研究的增多，人們逐漸嘗試在心肌再灌注開始時應用某些藥物以模擬后處理機制，并取得了相同或相似的心肌保護作用〔3〕。曲美他嗪是歐洲心臟學會專家組建議中惟一提到具有潛在的抗心絞痛的代謝藥物，也是目前惟一經臨床多中心研究證實有抗心絞痛作用的代謝藥物，故本實驗嘗試應用曲美他嗪進行藥物后處理，觀察其是否對再灌注心肌具有保護作用。

實驗結果顯示應用曲美他嗪進行后處理后，相對于再灌注模型組，可使大鼠心肌梗死面積減少，血清AST、LDH、CK活性不同程度的降低，心肌組織形態損傷有較大程度的減輕，心肌細胞超微結構損傷也有較大程度的減輕，其效果與經典的缺血后處理效果相當，顯示曲美他嗪后處理同樣可以減輕心肌的再灌注損傷。

再灌注損傷的發生機制目前認為主要是自由基增多和鈣超載所引起〔6〕。自由基增多可以使線粒體膜發生脂質過氧化，使線粒體結構和功能受損，并破壞膜上離子轉運蛋白〔7〕;鈣超載則可以促進自由基生成，并且能加重細胞內酸中毒，還可以激活多種磷脂酶，破壞細胞內膜結構。而TMZ可選擇性抑制線粒體酶-長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶(KAT)〔8〕，直接抑制細胞內耗氧過多的脂肪酸β-氧化途徑，間接增加葡萄糖氧化分解，從而利用有限的氧，維持 ATP的產生，保證心臟的收縮功能〔9〕;并且可以提高自由基清除酶活性，抑制氧自由基對膜脂質過氧化反應，穩定細胞內的各種膜結構，減少細胞內酶的漏出〔10〕;同時還能減輕線粒體內鈣聚積，抑制Ca2+積聚引起的線粒體腫脹，維持線粒體功能〔11〕。在本次實驗中，通過光鏡及電鏡的觀察，顯示TMZ后處理通過上述可能的機制減輕了細胞結構損傷，尤其是線粒體結構的損傷，使瀕死心肌細胞得以存活，最終減小了心肌梗死面積，降低了心肌酶的釋放。臨床上隨著介入治療的廣泛開展，使得開通冠脈的同時進行曲美他嗪后處理成為可能，且簡便易行，值得進一步推廣。但此種方式仍需更多動物實驗以及臨床實驗的研究證實其可靠性和安全性。

1 Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003;285(2):H579-88.

2 Watanabe T，Niwa K，Niinuma H.Efficacy of postconditioning combined thrombus aspiration in patients with st-segment elevation myocardial infarction〔J〕.JAm College Cardiol，2012;59(13):E471-1.

3 Burley DS，Baxter GF.Pharmacological targets revealed by myocardial postconditioning〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2009;9(2):177-88.

4 睢大員，曲紹春，于小風，等.雷米普利對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機制探討〔J〕.中國實驗診斷學，2009;13(11):1501-3.

5 Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al.Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog〔J〕.Arch Pathol，1960;70:68-78.

6 Piper HM，Abdallah Y，Schafer C.The first minutes of reperfusion:a window of opportunity for cardioprotection〔J〕.Cardiovasc Res，2004;61(3):365-71.

7 Garciarena CD，Fantinelli JC，Caldiz CI，et al.Myocardial reperfusion injury:reactive oxygen species vs.NHE-1 reactivation〔J〕.Cell Physiol Biochem，2011;27(1):13-22.

8 Kantor PF，Lucien A，Kozak R，et al.The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme A thiolase〔J〕.Circ Res，2000;86(5):580-8.

9 Stanley WC，Marzilli M.Metabolic therapy in the treatment of ischaemic heart disease:the pharmacology of trimetazidine〔J〕.Fundam Clin Pharmacol，2003;17(2):133-45.

10 Wisel S，Khan M，Kuppusamy ML，et al.Pharmacological preconditioning of mesenchymal stem cells with trimetazidine protects hypoxic cells against oxidative stress and enhances recovery of myocardial function in infarcted heart through Bcl-2 expression〔J〕.J Pharmacol Exp Therap，2009;329(2):543-50.

11 Morillas Blasco PJ，Hernandiz Martinez A，Azorin Villena I，et al.Mitochondrial changes induced by trimetazidine in the myocardium〔J〕.Med Sci Monit，2005;11(6):BR162-7.