魚油對阿霉素誘導慢性心力衰竭大鼠心肌結構和細胞因子的影響

滕麗莉 趙蔭濤 邵 莉 江 華 張代富 張 華

(同濟大學附屬東方醫院老年醫學科，上海 200120)

慢性心力衰竭(CHF)是各種原發性或繼發性心血管疾病發展到一定階段的共同表現，不僅嚴重危害人類的健康，而且對患者、家庭和社會帶來了沉重的醫療負擔。目前，世界各國CHF的發生率均呈上升趨勢，死亡率居高不下。由于心衰的高發病率及高病死率，CHF的發病機制及治療歷來都是人們研究的重點。本實驗主要采用阿霉素誘導建立大鼠心衰模型，使用魚油對心衰大鼠進行干預，旨在探討魚油對阿霉素誘導的心力衰竭大鼠的心肌結構和細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠46只(購于復旦大學實驗動物科學部)，稱重(250±20)g。隨機分成2組:對照組(n=10)和阿霉素組(n=36)。

1.2 試劑與儀器 小動物高分辨率體內超聲檢測儀;高頻超聲探頭(加拿大Visual Sonics公司);阿霉素(注射用鹽酸多柔吡星，浙江海正藥業股份有限公司);鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫藥有限公司);CM1900冰凍切片機(Leica公司);酶標儀(MK3，芬蘭Thermo);大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-αELISA試劑盒，大鼠白介素(IL)-10 ELISA試劑盒(均為上海西唐生物科技有限公司進口分裝)。

1.3 大鼠CHF模型的建立 大鼠腹腔注射阿霉素溶液1 ml/kg(按2 mg/kg阿霉素，用生理鹽水配成2 mg/ml，即1 ml/kg阿霉素，根據體重變化調整藥物劑量，每周1次，造模時間共持續8 w，累計用量約16 mg/kg)。對照組大鼠腹腔注射等體積的無菌生理鹽水(注射時間同阿霉素組，共8 w)。實驗過程中定期觀察大鼠的精神狀態、活動量、進食量、體重等大體情況。

1.4 超聲心動圖對動物模型進行評價 大鼠腹腔注射氯胺酮(2 ml:0.1 g，對照組按100 mg/kg，ADR組按70 mg/kg)全身麻醉，8%Na2S脫去大鼠前胸部皮毛。采用小動物高分辨率體內超聲檢測儀vevo770模式，在給藥后行經胸高頻超聲心動檢查。在二維切面上顯示胸骨旁左心長軸，M型超聲心動圖法測量，測量指標有左室舒張末期內徑(LVDD)、左室收縮末期內徑(LVSD)等，并自動計算出左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)。所有指標均在3個連續的心動周期中完成，獲取數據存儲于光盤中。所有測量工作均由有經驗的醫師在同一超聲儀上完成。

1.5 魚油干預結束后采用超聲心動圖進行評價 造模后的26只阿霉素組大鼠隨機分為2組:心衰組和魚油組，每組13只，以及對照組大鼠10只，每周測體重一次，根據體重調整藥物劑量。魚油組(n=13):劑量按體重的0.6%灌胃，每天1次，共8 w;心衰組(n=13):等量生理鹽水灌胃，共8 w;對照組(n=10):等量生理鹽水灌胃，共8 w。實驗過程中定期觀察大鼠的精神狀態、活動、毛色、進食、腹水、體重等大體情況。干預結束后再次用同樣的方法對心衰組及魚油組大鼠進行超聲心動圖檢查。

1.6 心肌HE染色 斷頭處死所有大鼠，取心肌組織先經液氮速凍，放置－80℃冷凍后制備冰凍切片，常規HE染色，光學顯微鏡觀察其組織學特點。

1.7 細胞因子的檢測 斷頭處死大鼠時留取抗凝血4 ml，于4℃下1 500 r/min離心10 min，取上清，分裝凍存于－80℃ 冰箱，集中采用ELISA法檢測TNF-α和IL-10水平。

1.8 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，數據用x±s表示。

2 結果

2.1 造模結束后超聲心動圖指標 動物均分籠飼養在18℃ ～20℃SPF環境中，自由取食和飲水，第8周末共有26只阿霉素組大鼠存活。造模結束后給兩組大鼠做心臟超聲，結果發現阿霉素組存活的大鼠心腔普遍擴大，室壁活動度減弱，均出現心功能指標異常，LVDD、LVSD明顯升高，與對照組相比有統計學差異(P＜0.05)，LVEF和LVFS明顯低于對照組(P＜0.05)，表明有左心室收縮功能障礙。對照組大鼠超聲心動圖檢查均未發現心功能異常。見表1。

表1 正常對照組和阿霉素組大鼠第8周末超聲心動圖心功能指標(x±s)

2.2 魚油干預結束后超聲心動圖進行評價 與對照組相比，心衰組LVDD、LVSD均顯著增加(P＜0.05)，LVEF、LVFS均降低(P＜0.05)。而魚油組LVDD、LVSD均較心衰組顯著降低(P＜0.05)，LVEF、LVFS均較心衰組顯著增加(P＜0.05)。見表 2，圖 1。

圖1 3組大鼠心臟超聲比較

表2 各組大鼠心臟超聲指標比較(x±s)

2.3 心肌形態結構改變 圖2可見，心肌組織HE染色顯示:對照組心肌細胞排列整齊，細胞間隙正常，胞核清晰，高倍鏡下可見清晰橫紋，未見胞體水腫，組織間隙無炎性滲出;心衰組大鼠心肌細胞失去正常結構形態、排列明顯不規則、部分呈水腫和空泡變性，部分出現灶性壞死，部分心肌纖維出現溶解斷裂，心肌細胞間隙明顯增寬，可見中性粒細胞及單核細胞、淋巴細胞的浸潤;PUFA組可見心肌細胞變性和壞死，心肌細胞間隙增寬，但程度和范圍均較心衰組減輕。

圖2 光鏡下大鼠心肌組織HE染色圖片(×400)

2.4 細胞因子的變化 與對照組相比，心衰組TNF-α和IL-10濃度升高，且上調IL-10/TNF-α比值(P＜0.05);與心衰組相比，魚油組TNF-α和IL-10濃度降低，且下調IL-10/TNF-α比值(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-10和IL-10/TNF-α 的變化(x ± s，pg/ml)

3 討論

CHF是指于心排出量絕對或相對減少，不能滿足機體組織需要的一種病理生理狀態。目前用于CHF動物模型的制作方法較多，主要有以下幾大類:①壓力超負荷所致，包括有主動脈縮窄，主動脈狹窄，肺動脈縮窄，肺動脈狹窄和實驗性高血壓動物〔1〕;②容量超負荷過度所致，包括快速大量輸液，二尖瓣關閉不全，主動脈瓣關閉不全，動靜脈瘺，下腔靜脈狹窄〔1〕;③心臟快速起搏所致〔1〕;④結扎冠狀動脈或冠脈內注入微栓子〔1〕;⑤遺傳性心衰模型〔2〕;⑥心肌毒性及抑制藥物:如阿霉素多用于建立慢性心衰模型，普萘洛爾、戊巴比妥鈉、維拉帕米多用于建立急性心衰模型〔1〕。

阿霉素是一種廣譜高效的蒽醌類腫瘤化療藥物，對白血病、淋巴瘤等多種腫瘤的化療效果良好。由于它的心肌組織高親和性而具有嚴重的心臟毒性，長期大劑量使用會引起中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，甚至出現嚴重的心力衰竭。本實驗發現阿霉素組大鼠在給藥第2周后普遍出現了食欲下降、活動量減少、發紺、腹瀉、口鼻周圍有粉紅色分泌物等CHF的常見表現，并且心臟超聲檢查結果顯示給藥組大鼠心臟擴大，心腔擴大，室壁活動度明顯減弱，LVEF值逐漸降低，大鼠LVDD進行性增加，心室收縮和舒張功能均減退，均與人類臨床擴張型心肌病特征相符，因此該實驗提供了建立阿霉素大鼠的心肌病及CHF模型的方案。

魚油中富含一系多不飽和脂肪酸，尤其是其中的廿碳五烯酸，和廿二碳六烯酸，具有降低血脂、抗血栓形成、延緩動脈粥樣硬化和冠狀動脈成形術后再狹窄閉、抗心律失常、影響血壓及改善血液流變學等多種心血管效應〔3〕。目前各國研究者在魚油的作用機制及其對機體的損害、應用等方面的研究已取得很大進展，魚油制劑在人類心血管疾病防治工作中的地位日益受到重視。一項大規模的臨床研究〔4〕結果顯示，在指南心力衰竭標準治療的基礎上，相對于一種常用降膽固醇藥，魚油補充劑對治療CHF可能更有效。本結果說明細胞因子之間的網絡調控參與了心力衰竭的發生、發展;利用HE組織切片染色證實了魚油對阿霉素誘導的心衰大鼠的保護作用。TNF-α具有許多不良作用〔5〕，包括心室重構、心肌抑制、心肌細胞凋亡等，TNF-α在體內外均有負性肌力作用。近年來IL-10在多種心血管病的發生發展中的作用均有報道，有研究表明〔6〕IL-10作為一種抗炎性細胞因子，能中和充血性心力衰竭過程中產生的炎性細胞因子，可直接對抗心肌由炎性細胞因子介導的損害，對心臟有保護作用。Yamaoka等〔7〕觀察68例各種原因的CHF患者和31例正常對照患者的循環IL-10和IL-10受體水平，發現CHF組IL-10和TNF-α水平均高于對照組。應用魚油干預阿霉素致心衰大鼠8 w后，心衰組大鼠血清的炎性細胞因子TNF-α、IL-10表達水平顯著下降。IL-10/TNF-α比值也較心衰組降低，該比值反映促炎抗炎平衡狀態，越接近平衡狀態越有利于炎癥性疾病的恢復。因此，我們推測n-3PUFAs可能通過調節細胞因子TNF-α和IL-10等的表達來改善心功能。這與文獻報道的多不飽和脂肪酸攝入量和炎癥細胞因子的相關性是一致的。魚油的抗炎作用已經有很多相關報道〔6，8〕，許多研究結果表明，飲食攝入足量的魚油對減少心衰患者的炎癥因子水平是有益的。

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5 Valgimigli M，Ceconi C，Malagutti P，et al.Tumor necrosis factor-alpha receptor 1 is a major predictor of mortality and new-onset heart failure in patients with acute myocardial infarction:the Cytokine-Activation and Long-Term Prognosis in Myocardial Infarction(C-ALPHA)study〔J〕.Circulation，2005;111(7):863-70.

6 Aukrust P，Ueland T，Lien E，et al.Cytokine network in congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy〔J〕.Am JCardiol，1999;83(3):376-82.

7 Yamaoka M，Yamaguchi S，Okuyama M，et al.Anti-inflammatory cytokine profile in human heart failure:behavior of interleukin-10 in association with tumor necrosis factor-alpha〔J〕.Jpn Circ J，1999;63(12):951-6.

8 Hoorn EJ，Geary D，Robb M，et al.Acute hyponatremia related to intravenous fluid administration in hospitalized children:an observational study〔J〕.Pediatrics，2004;113(5):1279-84.