二色補血草總黃酮的提取純化及其對大鼠激素水平的影響

歐 莉 苗彥霞 衛培峰 王 杰

(陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046)

二色補血草是白花丹科補血草屬的多年生草本植物，別名血見愁、蒼蠅花 、蠅子草、燎眉蒿。主產于河北、河南、山西、內蒙古、陜西、甘肅等地〔1〕。全草入藥，性味甘平，補血益氣，止血散瘀。主治功能性子宮出血、宮頸癌、月經不調、腎盂腎炎、胃潰瘍等癥〔2〕。二色補血草以其確切的藥用價值而備受人們關注，近幾年來對此藥材的開發利用也逐漸深入〔3，4〕，研究結果發現二色補血草主要含黃酮、鞣質、生物堿、沒食子酸等物質，其乙醇提取物能明顯縮短小鼠出、凝血時間〔5，6〕。本論文以二色補血草醇提液為原料，利用大孔樹脂對其總黃酮進行純化處理，并探討其對去勢大鼠血清雌二醇(E2)及孕酮(P)的影響，從而進一步揭示二色補血草總黃酮治療功血的作用機制，以期為臨床應用提供了一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 UV-1102紫外分光光度計，上海天美科技儀器公司;BS124S電子天平，德國塞多利斯有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發器，上海亞榮儀器廠;DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 材料與試劑 二色補血草購自陜西眉縣德爾康藥材公司;蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所;D101樹脂購自西安藍深交換吸附材料有限公司;E2、P放免試劑盒由天津市協和醫藥科技有限公司提供，批號:201108;宮血寧膠囊:0.113 g/粒，由云南白藥集團股份有限公司提供，批號:20110408。青霉素注射液，規格:160萬U/ml，由哈藥集團制藥總廠提供，批號:A110810910。

1.3 方法

1.3.1 二色補血草總黃酮的提取與純化

1.3.1.1 對照品溶液的制備 精確稱取蘆丁標準品100 mg，用60%乙醇溶解，定容于25 ml容量瓶中，即得蘆丁對照液體，濃度為4 mg/ml。

1.3.1.2 標準曲線的繪制 采用硝酸鋁比色法，在波長510 nm處測定吸光度。溶液的吸光度Y和黃酮的濃度X的關系為:Y=2.376 5X－0.020 8(線性質量范圍為0.040 0～0.160 0 mg/ml，R2=0.999 5)，X 的單位為 mg/ml。

1.3.2 二色補血草總黃酮的提取 稱取一定量的二色補血草，用10倍量的60%乙醇溶液，于50℃水浴中提取3 h，共回流提取2次〔7〕，過濾，減壓濃縮至生藥量0.24 g/ml，過濾得二色補血草醇提取液。

1.3.3 二色補血草總黃酮的純化 采用D101樹脂對二色補血草總黃酮進行純化，靜態吸附12 h后，先用水(3倍量)進行洗脫，去掉濾液。再用70%乙醇(5倍量)進行洗脫，旋轉蒸發回收乙醇，合并濾液，按1.3.1.2測定其吸光度。

1.3.4 二色補血草總黃酮的含量測定 精密稱定0.14 g(5 ml)二色補血草總黃酮提取物，溶于40 ml 60%乙醇溶液中，定容至 50 ml。取 1 ml，加水至 4 ml，加 5%NaNO20.4 ml，放置6 min，加 10%NaNO20.4 ml，放置 6 min，加 4.3%NaOH 4 ml，加水定容至10ml，搖勻后放置15min。在330nm波長處測定吸光度。根據標準曲線Y=2.376 5X－0.020 8(線性質量范圍為0.040 0 ～0.160 0 mg/ml，R2=0.999 5)，計算二色補血草總黃酮含量。

1.3.5 二色補血草總黃酮對去勢大鼠血清指標的影響

1.3.5.1 動物造模 取180～220 g雌性SD大鼠90只 ，適應性喂養7 d。行卵巢切除術而進行去勢造模。術后用青霉素40萬U·kg－1·d－1肌注，連用3 d，于術后第7天進行陰道脫落細胞涂片檢查，并連續檢查5 d，以陰道涂片不出現角化上皮細胞作為去勢造模成功指標。

1.3.5.2 動物分組及指標測定 選取造模成功的大鼠60只，隨機分為6組，每組10只，分別為二色補血草總黃酮低、中、高劑量組、二色補血草水煎液組、宮血寧對照組和模型對照組。每天灌胃給藥1次，連續給藥14 d，末次給藥后進行眼眶取血，采用酶免試劑盒檢測血清E2、P水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 二色補血草總黃酮的含量測定 二色補血草醇提液濃縮至生藥量0.24 g/ml，純化后浸膏中總黃酮含量為65.46%，即每克浸膏中含總黃酮0.065 46 g。

2.2 對去勢大鼠血清E2與P的影響 行卵巢切除術制造對大鼠進行去勢造模成功，其模型對照組的各項所測指標與假手術組組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。給藥后，二色補血草總黃酮各劑量組和宮血寧組均可提高去勢大鼠血清中E2和P的含量，其中二色補血草總黃酮高劑量組對模型大鼠血清中的E2水平具有明顯的改善作用(P＜0.01)，且呈現一定的量效關系，陽性對照藥宮血寧也可顯著提高模型大鼠血清中的E2水平(P＜0.05)。見表1。

表1 二色補血草總黃酮對去勢大鼠血清E2、P 的影響(n=10，x±s)

3 討論

二色補血草中含有大量的化學成分，其中的黃酮類化合物因分子中具有酚羥基，故顯酸性。一般黃酮苷元難溶于水，易于溶于乙醇，甲醇，乙醚，氯仿等有機溶劑中，因此選擇乙醇作為溶劑提取黃酮，可有效提高原料的提取率。故本實驗參照以往實驗優化工藝，采取料液比為1∶15，濃度為60%的乙醇為提取劑，于50℃水浴中提取3 h，共回流提取2次，并采用D101樹脂對二色補血草總黃酮進行純化。

根據排卵與否，通常將功血分為無排卵型及排卵型兩大類，前者最為多見，約占80% ～90%。由于卵巢功能衰退，卵泡數明顯減少，且對促性腺激素敏感性降低，雌激素明顯減少，促性腺激素水平升高，因達不到雌激素的正反饋水平而無排卵前LH峰形成，以致無排卵。由于卵巢不能有規律的排卵，孕激素缺乏，子宮內膜因在單一雌激素作用下而發生不同程度的增生。當雌激素水平突然下降或波動幅度較大時，則發生雌激素撤退性或突破性出血。本實驗結果表明，二色補血草總黃酮可能通過雌激素樣物質與孕激素樣物質的共同協同作用而治療功血，可避免由于功血患者體內雌激素過多，孕激素缺乏，導致雌激素突破性的出血情況發生。但二色補血草總黃酮是如何作用于子宮內膜靶器官，是否能促使功血患者子宮內膜的修復還需要做進一步的探索研究。

1 王振恒，張 繼，哈 飛.等.二色補血草資源綜合開發利用〔J〕.中華實用中西醫雜志，2005;18(7):1076-8.

2 白 瑩，符永鵬，王文英.等.二色補血草不同部位總黃酮類物質提取及抗氧化能力的研究〔J〕.光譜實驗室，2009;26(3):467-9.

3 田福平，時永杰，陳子萱.我國補血草屬野生植物資源的分布及研究現狀〔J〕.草業與畜牧，2010;172(3):49-52.

4 許毅洪，李福生，趙洪濤.人工栽培二色補血草前景光明〔J〕.植物雜志，2004;1(1):12-3.

5 張 敏，唐旭利，李國強.濱海濕地耐鹽植物二色補血草化學成分研究〔J〕.中國海洋大學學報，2010;5(5):89-92.

6 苗彥霞，衛培峰，莫小麗.二色補血草對小鼠出、凝血時間影響的實驗研究〔J〕.陜西中醫，2008;29(6):751-2.

7 許瑩堂，張愛平，李平菊.二色補血草花總黃酮化合物提取工藝研究〔J〕.文山師范高等專科學校學報，2005;18(2):122-4.