大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區超微結構及Apaf-1表達的變化

劉 瑞 高維娟 錢 濤 王 利

(承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

腦缺血再灌注損傷是指缺血腦組織在一定條件下恢復血液供應后，出現了更加嚴重的腦功能障礙和結構損傷，常見于休克、DIC微循環再通、腦血管栓塞再通、心肺腦復蘇等。缺血性腦血管疾病〔1〕是臨床神經科的常見疾病，其致殘、致死率高，治療原則是及時恢復缺血區的血液供應，但同時也造成了再灌注損傷，抑制再灌注損傷已成為治療缺血性腦血管疾病的重要環節〔2〕。本實驗通過建立全腦缺血再灌注大鼠模型，觀察大鼠全腦缺血再灌注損傷后海馬超微結構及凋亡蛋白激活因子(Apaf)-1表達的變化，探討腦缺血再灌注損傷的發生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠，SPF級動物，體重260～280 g，鼠齡2～3個月，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2009-0004。SD大鼠適應性飼養1 w后隨機分為假手術組和模型組，其中模型組根據再灌注后不同時間點再分為2、24、72 h 3個亞組。

1.2 試劑和儀器 小鼠抗大鼠Apaf-1單克隆抗體，小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;免疫組化試劑盒購自北京中山金橋公司;HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑為國產分析純。WH-A300W型高頻電刀:北京市朝陽維思通工程電器廠生產;石蠟包埋機，石蠟切片機:德國LEICA生產;光學顯微鏡:日本OLYMPUS生產;H-7650透射電子顯微鏡:日本日立公司生產;TDL-40B離心機:上海安亭科學儀器制造廠;DYY-6B型穩壓穩流電泳儀:北京六一儀器廠。

1.3 模型制備 采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制作大鼠全腦缺血再灌注模型:大鼠于術前12 h禁食，4 h禁水，4%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥位固定于固定臺上，頸背側正中縱切口約1.5 cm，逐層鈍性分離頸旁肌暴露雙側第一頸椎橫突翼狀孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼其中的椎動脈，造成永久性閉塞，縫合切口。然后將大鼠仰臥位固定，行腹側頸正中切口，分離雙側頸總動脈并以“4”號線穿線備用，縫合切口。24 h后將大鼠乙醚麻醉，迅速打開頸部切口暴露雙側頸總動脈，待大鼠清醒后用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈造成全腦缺血，缺血30 min后松開無創動脈夾恢復腦血液灌流，觀察大鼠行為學改變，以雙側頸總動脈夾閉后1 min內大鼠意識喪失、眼球變白、雙側瞳孔散大、對光反射消失、翻正反射消失作為全腦缺血模型成功的標準，且剔除全身強直、抽搐等異常反應或死亡的大鼠。假手術組只做皮膚切口和組織分離。

1.4 電鏡樣品及標本制備 每組于再灌注后相應時間點從每組大鼠中隨機選取6只4%水合氯醛腹腔注射麻醉，先經左心室灌注250 ml生理鹽水，再灌注含2.5%戊二醛的4%多聚甲醛300 ml，之后立即斷頭取腦，在冰上分離出海馬，將海馬CA1區切成1 mm3的小塊，迅速置于2.5%戊二醛中固定4 h，1%鋨酸后固定，常規梯度丙酮脫水，Epon812包埋，半薄切片選區，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，透射電鏡下觀察。

1.5 免疫組化法檢測海馬組織Apaf-1的表達 每組于再灌注后的相應時間點從每組大鼠中隨機選取6只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經左心室快速灌注250 ml生理鹽水，然后灌注4%多聚甲醛500 ml進行固定，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，連續冠狀切片，制成5μm厚切片。采用SP法檢測Apaf-1的表達，具體操作依據試劑盒說明書進行。小鼠抗大鼠Apaf-1單克隆抗體按1∶75稀釋，PBS代替一抗作陰性對照。選用Med6.0軟件測定陽性反應物灰度值:在切片的海馬CA1區各選取3個測量點，首先測定各點的顆粒細胞層灰度值，再用該值減去相應的背底灰度值后求平均值，即為大鼠海馬CA1區Apaf-1表達的免疫反應灰度值。

1.6 Western印跡法檢測海馬組織Apaf-1蛋白的表達 每組取6只大鼠海馬組織(－80℃保存)，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，取80μg蛋白樣品，以8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉移法轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，小鼠抗大鼠Apaf-1單克隆抗體(1∶200稀釋)4℃孵育過夜，山羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀釋)室溫搖床孵育1 h，洗膜后，采用ECL化學發光法顯色，目的條帶為130 kD，實驗重復5次。用凝膠分析軟件Quantity one進行定量分析。

1.7 統計學處理 結果以x±s表示，用SPSS11.5軟件采用單因素方差分析，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Games-Howell檢驗。

2 結果

2.1 海馬CA1區神經元超微結構變化 透射電鏡下觀察:假手術組大鼠海馬神經元胞核較大，呈圓形或橢圓形，核膜清晰完整，可見核孔，常染色質呈細顆粒狀，均勻分布，胞漿內可見豐富的細胞器，細胞器結構形態清晰。模型2 h組可見大鼠海馬神經元核膜鄒縮、凹陷，核染色質密度增高，線粒體輕微腫脹，可見溶酶體;模型24 h組可見大鼠海馬神經元核膜鄒縮凹陷嚴重，核仁物質增多、偏移，線粒體結構松散、空泡狀，線粒體嵴斷裂或消失，粗面內質網囊性變、脫顆粒，游離核糖體減少，可見溶酶體結構完整;模型72 h組可見大鼠海馬神經元核固縮，核染色質成團塊狀邊集于核膜下，線粒體不同程度脫空，可見溶酶體。見圖1。

2.2 免疫組化法檢測海馬組織Apaf-1蛋白表達 免疫組化染色結果:陽性反應為胞漿呈棕黃色。假手術組海馬只有少量Apaf-1蛋白表達，與假手術組相比，模型組各時間點 Apaf-1蛋白表達平均灰度值均增高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖 2，表 1。

2.3 Western印跡法檢測海馬組織Apaf-1蛋白表達 Apaf-1蛋白表達趨勢與免疫組化表達一致，見圖3，表1。

表1 腦缺血再灌注后大鼠海馬組織Apaf-1蛋白表達(x ± s，n=6)

圖1 各組海馬CA1區神經元超微結構(×20 000)

圖2 各組海馬組織Apaf-1蛋白表達(×400)

圖3 各組大鼠海馬組織Apaf-1蛋白

3 討論

缺血性腦血管病是以腦循環血量下降為特征的中樞神經系統的常見病及多發病，近年來，細胞凋亡在缺血性腦損傷發生機制中的作用逐漸被認識，1990年Shigeno等〔3〕首先提出全腦缺血的神經元死亡與凋亡有關，此后許多研究表明用不同動物模型和不同檢測方法所發現的細胞凋亡情況不同;不完全性短暫性腦缺血時，缺血細胞的早期形態變化與凋亡的形態學特征相一致〔4〕。

細胞凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因主要有Bcl-2家族、caspase家族、癌基因c-Myc、抑癌基因P53等，參與細胞凋亡的信號轉導通路很多，而在腦缺血再灌注損傷過程中，主要是JNK信號轉導通路，葉冬青等〔5，6〕研究表明，無論是離體培養的大鼠海馬神經元缺氧缺糖/復氧復糖后還是在體腦缺血再灌注大鼠海馬神經元，都可致JNK3的表達增加進而導致神經元凋亡。在JNK信號通路中，由于一系列的信號轉導級聯反應均以Apaf-1為靶子而調節凋亡體，因此Apaf-1被認為是凋亡體的核心〔7，8〕。Apaf-1在線粒體介導的細胞凋亡途徑中是這樣發揮作用的:絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)是一組分布于胞質的進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，激活的MAPK通過磷酸化多種轉錄因子、細胞骨架相關蛋白和其他酶類等蛋白底物來調節多種細胞生理過程。JNK是MAPK重要成員之一，目前所知JNK包括JNK1、JNK2和JNK3三種亞型，JNK1和JNK2廣泛分布于多種組織，JNK3主要分布于神經組織、睪丸及心肌細胞中。在鈣離子超載、氧自由基等應激刺激下，使位于細胞質的JNK3磷酸化而激活JNK信號轉導通路，磷酸化的JNK3逐漸轉移到細胞核內，促使高電導非選擇性通道PTP(PTP)開放和線粒體膜電位崩解，細胞色素C從線粒體內膜間隙釋放入胞質，在dATP/ATP存在的條件下，細胞色素C與胞漿中的Apaf-1結合，改變Apaf-1的構象，消除其自身多聚化的作用，使 procaspase-9與Apaf-1結合，并活化為caspase-9，進一步激活下游的效應因子 caspase-3、6、7 等，使細胞走向不可逆凋亡〔9，10〕。本實驗結果表明細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中發揮重要的作用，Apaf-1蛋白表達升高促進了神經元的凋亡，是腦缺血再灌注損傷的發生機制之一，這可能成為治療該類疾病新的分子靶點，為探索防治該類疾病的藥物開辟了新的研究方向。

1 崔海月，王慶國.缺血性腦血管病發病機制的新進展〔J〕.長春中醫藥大學學報，2009;25(2):291-2.

2 陳志強.缺血性腦血管病的研究進展〔J〕.亞太傳統醫藥，2010;6(7):159-62.

3 Shigeno T，Yamasaki Y，Kato G，et al.Reduction of delayed neuronal death by inhibition protein synthesis〔J〕.Neurosci Lett，1990;120:117-23.

4 張 輝，董建峰，呼東坡，等.川穹嗪對大鼠CIR頂葉皮質神經元超微結構及Caspase-9 mRNA表達的影響〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2009;18(4):417-21.

5 葉冬青，高維娟，閆鳳霞，等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元JNK3 mRNA的表達〔J〕.中國病理生理雜志，2009;25(9):1756-61.

6 Liu SS，Gao WJ，Qian T，et al.Effect of different doses of astragalus injection on neuronal apoptosis and expression of caspase-3 in hippocampus of rats after cerebral ischemia reperfusion〔J〕.Chin J Tissue Engineering Res，2012;16(20):3747-50.

7 Pourkarimi E，Greiss S，Gartner A.Evidence that CED-9/Bcl2 and CED-4/Apaf-1 localization is not consistent with the current model for C.elegans apoptosis induction〔J〕.Cell Death Differ，2012;19(3):406-15.

8 Gogada R，Amadori M，Zhang H，et al.Curcumin induces Apaf-1-dependent，p21-mediated caspase activation and apoptosis〔J〕.Cell Cycle，2011;10(23):4128-37.

9 焦俊霞，高維娟.Bcl-2、Bax和Cyt-c在神經系統疾病中作用機制的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(24):4982-5.

10 Kim J，Parrish AB，Kurokawa M，et al.Rsk-mediated phosphorylation and 14-3-3 varepsilon binding of Apaf-1 suppresses cytochrome c-induced apoptosis〔J〕.EMBO J，2012;31(5):1279-92.