山核桃外殼植物多酚的提取及抗氧化活性研究

方苗利

（浙江醫學高等專科學校，杭州，310053）

植物多酚也稱為植物單寧，是一類廣泛存在于植物葉、果實、根及樹皮等部位的多元酚化合物，在醫藥、食品、化工、農業和材料等領域的廣泛應用受到了人們的關注[1]。特別是植物多酚的抗氧化活性近年來更加受到了人們的重視[2-4]。

山核桃又名胡桃，植物胡桃科胡桃屬的一種。山核桃是浙江特有，并在全國占有重要地位的名特優產品。山核桃產生的外殼量很大，大部分都廢棄在山中，從而污染環境、危害動植物的生存。而山核桃外皮含有酚類、鞣質、有機酸、生物堿、氨基酸、肽、蛋白質、糖、多糖、配糖(甙)、皂甙、甾體、黃酮體、香豆素、萜類內脂化合物和蒽醌類等化合物。2011年，曹鵬飛報道了用有機溶劑法從山核桃外殼中提取植物多酚的研究，并對不同的溶劑、溫度、提取時間、固液比對植物多酚提取率進行了詳細的討論，為解決山核桃外殼的綜合利用和進一步開展植物多酚化合物的研究提供了思路[5]。

利用山核桃外殼中提取的植物多酚開展抗氧化活性研究，可以進一步擴大山核桃的種植規模，為地方經濟服務。因此，在本研究中首先利用水、丙酮水溶液和聚乙二醇水溶液對山核桃外殼植物多酚進行了提取，在此基礎上進行了提取物對油脂的抗氧化活性和對1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力的研究。

1 實驗部分

1.1 試劑和原料

試劑：乙二胺四乙酸二鈉，氨水，氯化銨，醋酸鋅，鉻黑T，丙酮，乙醇，聚乙二醇400，硫代硫酸鈉，氯仿，甲醇，水楊酸，2,6-二叔丁基對甲酚，DPPH，均為市購化學純。

原料：山核桃外殼。

1.2 植物多酚的提取方法

將30℃烘干除雜質的核桃外殼10 g粉碎，裝入250 mL的錐形瓶中，在60℃溫度下，加入提取劑80 mL，攪拌浸提10 h后，趁熱過濾、洗滌，濾液進行植物多酚含量測定。

1.3 植物多酚含量測定

Zn2+有較好的選擇性，只與植物多酚絡合。以過量的醋酸鋅為絡合沉淀劑加到植物多酚溶液內，在pH=10、35℃下反應30min，溶劑內多余的Zn2+以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）滴定。1mL濃度1mol/L的醋酸鋅消耗EDTA 0.155 6 g。具體步驟參照文獻[6]提供的方法，從而計算植物多酚的含量。

1.4 抗氧化性試驗

1.4.1 對油脂的抗氧化性

油脂在氧化過程中，氧與不飽和碳鏈化合生成過氧化物，過氧化物與碘化氫反應使碘離子氧化析出碘，然后用硫代硫酸鈉標準溶液測定析出的碘，根據硫代硫酸鈉的消耗量可以得到油脂的過氧化值（POV）,通過POV可評價油脂的氧化程度[7-8]：

式中，V1和V2分別為樣品和空白消耗硫代硫酸鈉標準溶液體積，c為硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，m為樣品質量。

將新鮮豬油切成小塊，用文火濕法熬煉，雙層紗布過濾除去殘渣，冷卻、密封后放入低溫冰箱備用。各取50 g新鮮豬油，1個做空白試驗，1個加入山核桃外殼提取物，提取物分別按豬油質量的0.02%、0.2%、0.5%、1%加入，可以加入適量乙醇溶解。置50℃水浴中緩慢加熱并攪拌下融化，然后在70℃恒溫箱中保存，每12 h攪拌1次，并確保2個樣品在同樣的環境條件。

測定時，準確稱取試樣3 g置于250 mL燒瓶中，加30 mL氯仿-冰醋酸混合液，使樣品完全溶解。加入1mL飽和碘化鉀溶液，輕輕震蕩30 s，然后在暗處放置10 min，取出加入100 mL水，搖勻，立刻用1mmol/L的硫代硫酸鈉溶液滴定，至淡黃色時加1 mL淀粉指示劑，繼續滴定至藍色消失為終點。每隔24 h平行測定2個樣品的POV，取樣時要充分振蕩使之混入足夠的空氣。

1.4.2 清除DPPH自由基活性

DPPH自由基是一種穩定的以氮為中心的脂溶性的質子自由基，具有穩定、靈敏和簡便等優點，被廣泛的應用于評價短時間內的抗氧化性研究。該測定方法是根據在電子供體的存在下，穩定的DPPH自由基由紫色轉化為黃色，其色變程度與其接受的電子呈定量關系，清除自由基能力越強，吸光度越小。吸光度采用分光光度計檢測[9]。

溶液配制：DPPH樣品為0.2 mmol/L的甲醇溶液，提取物分別配成質量濃度1 mg/mL和0.1 mg/mL的甲醇溶液。

分別測定未加樣品液的DPPH溶液、樣品液和加入樣品液反應后DPPH溶液在517 nm下吸光度A0、As和A，計算清除率：

2 結果與討論

2.1 植物多酚的提取

目前通過文獻提供的提取方法，主要是采用水或丙酮的水溶液。從溶劑的回收再利用，或者是溶劑的使用安全考慮，使用聚乙二醇400水溶液作為提取劑，在反應時間為10 h、溫度為60℃的條件下進行了提取實驗，結果見表1。

表1 植物多酚在不同溶劑中的提取率Tab 1 Extraction yield of plant polyphenols in different solvents

從表1可以看出，直接采用水提取率最高。

2.2 抗氧化性

將山核桃外殼提取物0.010、0.025、0.10、0.25、0.5 g分別加入到50 g豬油中，測定POV，結果見圖1。

圖1 植物多酚對豬油的POVFig 1 POV results of different plant polyphenols to lard

從圖1可以看出，提取物對豬油的氧化具有很好的抑制作用。隨著提取物加入量的增加，抗氧化性逐漸增強，當提取物的加入量為0.10 g時，氧化效果最佳。但是隨著提取物加入量的再增加，抗氧化效果有些下降。分析認為，多酚類物質自身不穩定，隨著提取物量的增加，易發生自身氧化而使抗氧化作用降低；或者是多酚氧化物的顏色對測定結果有些影響。

2.3 清除DPPH自由基活性

山核桃外殼提取物對清除DPPH自由基的測定結果見圖2。

圖2 植物多酚對清除DPPH自由基的測定結果Fig 2 Determination results of DPPH free radicals removed by plant polyphenols

從圖2可以看出，清除率隨著提取物的質量濃度的增加而增加，到100 mg/L時，清除率可達到90%以上。

3 結論

通過利用水、丙酮水溶液和聚乙二醇水溶液對山核桃外殼中植物多酚的提取結果表明，水是最佳的提取劑。該方法安全、效果好、無污染，可以變廢為寶，有較好的應用價值。

通過山核桃外殼提取的植物多酚對油脂的抗氧化性和清除DPPH自由基的實驗結果表明，山核桃外殼提取物對油脂的抗氧化和清除DPPH自由基具有良好的效果。試驗中使用的提取物是未經純化的粗品，經過深加工后，效果會更好。

[1]黃占華,方桂珍.植物單寧的應用及研究進展[J].林產化工通訊,2005,39(5):39-43.

[2]金瑩,孫愛東.植物多酚的結構及生物學活性的研究[J].中國食物與營養,2005(9):27-29.

[3]邵芳芳,尹衛平,梁菊.重要的植物多酚及其抗氧化性能的研究概況[J].西北藥學雜志,2010(1):66-68.

[4]徐竟一,李姍珊.蘋果多酚的抗氧化性研究[J].廣西輕工業,2011(5):13-14.

[5]曹鵬飛.山核桃外殼單寧提取的工藝條件研究[J].江西林業科技,2011(4):60-64.

[6]楊文云,李志國,吳昊,等.絡合法測定塔拉單寧含量的研究[J].西南林學院學報,1999,19(4):249.

[7]寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京:中國輕工業出版社,1998:167.

[8]揚惠芳,李明元,沈文.食品衛生理化檢驗標準手冊[M].北京:中國標準出版社,1998:67.

[9]Barry H.Free radicals in biology and medicine[M].Oxford:Charendon Press,1985:37.