虎金丸對肝纖維化大鼠Nrf2/Bach1蛋白表達的影響

符 崖 黃兆勝 熊天琴 李紅俠 趙玉民 廖嘉儀

廣州中醫藥大學，廣東廣州 510006

在肝纖維化的發生發展中，氧化應激起著重要作用，機體氧化/抗氧化的失衡，是肝臟炎癥及肝纖維化的發展重要因素之一。核因子相關因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）、轉錄因子 Bach1（BTB and CNChomology1）在機體氧化/抗氧化失衡的調節中起著重要的作用，Nrf2通過調節肝臟抗氧化酶基因的表達增加肝臟抵抗氧化應激的能力；Bach1為Nrf2的阻遏劑，和Nrf2競爭ARE下調抗氧化酶基因的表達[1-4]。

虎金丸由虎杖、郁金、田七、靈芝、澤瀉、山楂6味組成，具有活血化瘀、益氣行滯的功效。臨床上用于治療肝纖維化有較好的療效[5]。研究表明虎金丸能保護CCl4所致大鼠肝細胞急性損傷，具有確切的抗肝纖維化作用[6]。本研究采用CCl4誘導的大鼠肝纖維化，觀察虎金丸對肝纖維化大鼠Nrf2/Bach1蛋白表達的影響，初步探討虎金丸調整機體氧化應激抗肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠，SPF級，體重150～180g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，生產許可證號SCXK（粵）2008-0020。

1.2 藥物及試劑

虎金丸供試液系按處方比例各藥材加水煎煮2次，過濾，濃縮為含生藥1g/mL，臨用時稀釋備用；陽性對照藥水飛薊素（陜西森弗高科實業有限公司）；四氯化碳（廣州光華化學廠有限公司，批號20110930）；MDA、SOD、GSHPx檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；兔抗Nrf2多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，規格1mg/mL），兔抗Bach1多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，規格37μg/150μL）。Elevision plus免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發公司）；Masson三色染色液（廣州威佳科技有限公司，批號20110315）；蘇木素和伊紅（Sigma進口分裝，批號 20110211）。

1.3 儀器

7080型日立全自動生化分析儀器株式會社日立高新技術）；UV-754紫外可見分光光度計（上海科學精密儀器有限公司）；TG-16-WS臺式高速離心機（長沙湘儀離心機器有限公司）；體重計，大連星海電子衡器有限公司；MIAS圖像分析系統（廣州中醫藥大學一附院病理室）；MSHOT數碼成像系統（廣州市明美光電技術有限公司）。

1.4 造模及給藥方法

雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、水飛薊素組、虎金丸組，每組10只。模型組和給藥組皮下注射40% CCl4花生油溶液（將CCl4與花生油以4∶6配成40%油劑），首次0.5mL/100g，隨后0.3mL/100g，隔天1次，持續6周。正常組皮下注射等體積的花生油，時間與模型組相同。造模結束后，給藥組灌胃相應藥物，每日1次，共4周。模型組、正常組灌胃等體積的蒸餾水。為了防止肝臟自然修復對實驗結果的影響，除正常對照組外，各用藥組開始給藥后仍同時每周注射40% CCl4油劑0.3mL/100g體質量1次[7]。

1.5 采集標本

末次給藥前禁食不禁水12h，末次給藥后1h，用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采集血液，將血液室溫靜置2h后，2500r/min，離心20min，取上清，-80℃保存備用。采集血液后將動物處死取肝臟標本，置于冰0.9%氯化鈉溶液中充分洗滌后，稱重，取肝右葉標本1cm×1cm×0.5cm，用10%（v/v）的中性甲醛固定，制備石蠟切片。取肝左葉用生理鹽水制成10%的肝勻漿。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 肝臟組織病理學觀察 肝組織病理學檢查采用膠原纖維染色（Masson法），在光鏡下觀察大鼠肝組織肝纖維化程度并拍照。MIAS醫學圖像分析管理系統分析并自動計算膠原纖維面密度。

1.6.2 分光光度法檢測 檢測肝組織勻漿中SOD、GSH-Px含量

1.6.3 免疫組化法檢測肝組織勻漿Nrf2、Bach1的蛋白量的差異 肝組織標本經10%甲醛液固定，石蠟包埋，4μm連續切片貼于經APES處理的載玻片。免疫組化按Elevision plus試劑盒要求操作。PBS代替一抗作為陰性對照。用MSHOT數碼成像系統采集圖像，MIAS醫學圖像分析管理系統分析并自動計算平均光密度。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 Masson染色膠原纖維觀察

正常組肝組織形態結構正常，除肝中央靜脈周和肝血竇周見少量的網狀纖維，無明顯膠原纖維增生。模型組肝組織結構被破壞，肝索排列紊亂，局部的網狀纖維融合形成膠原纖維條索，使肝小葉中央區和匯管區的纖維間隔相互連接，改建肝小葉結構和血液循環形成了假小葉。肝組織損傷減輕，肝索排列整齊，膠原纖維增生顯著減少。

在Masson染色中，纖維蛋白呈黃綠色，運用MIAS醫學圖像分析管理系統分析膠原纖維的面密度，根據面密度值判斷大鼠纖維化的程度。與正常組比較，模型組的面密度顯著增大（P＜0.01），面密度值為（0.206±0.059）。與模型組比較，水飛薊素與虎金丸均能顯著減低纖維蛋白的含量（P＜0.01），且虎金丸的作用更顯著。見表1。

表1 Masson染色膠原纖維面密度結果比較（± s）

表1 Masson染色膠原纖維面密度結果比較（± s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 面密度正常組 8 0.014±0.008模型組 8 0.206±0.059▲▲水飛薊素組 8 0.100±0.035**虎金丸組 8 0.079±0.037**

圖1 大鼠肝組織Masson染色膠原纖維觀察（100倍）

2.2 大鼠肝組織勻漿中GSH-Px與SOD含量的變化

與正常組相比，模型組的抗氧化酶GSH-Px與SOD含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，兩藥物組均使GSH-Px與SOD含量顯著升高（P＜0.01），表明藥物的使用增強了機能的抗氧化酶含量，達到了保護肝臟的作用。見表2。

表2 大鼠肝組織勻漿中SOD、GSH-Px的含量比較（± s）

表2 大鼠肝組織勻漿中SOD、GSH-Px的含量比較（± s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

水飛薊素組 10 256.291±58.119** 552.267±25.055**虎金丸組 10 254.718±7.854** 528.869±66.003**

2.3 大鼠肝組織勻漿Nrf2、Bach1蛋白的改變

與正常組比較，模型組肝細胞漿中的Nrf2蛋白顯著升高（P＜0.01），Bach1蛋白顯著降低（P＜0.01）。見圖2：A1、A2、B1、B2。與模型組比較，虎金丸、水飛薊素組肝細胞胞漿中的Nrf2蛋白顯著降低，Bach1蛋白顯著增高（P＜0.01）。見圖2：C1、C2、D1、D2。兩組之間的蛋白水平差異小。見表3。

3 討論

肝纖維化是各種肝損傷的共同的終末階段。正常的肝纖維結締組織的生成與分解保持動態平衡，當肝組織受到不同損傷時（如藥物性、酒精性損傷），肝纖維組織彌漫增生大于分解，導致肝纖維化[8]。研究表明，虎金丸對誘導的大鼠肝纖維化有較好治療作用，能夠保護肝細胞，抑制膠原纖維增生，其機理與抗脂質過氧化有關[9]。現代藥理研究表明，虎杖鞣質具有較好的抗脂質過氧化的作用[10]，郁金主要有效成分姜黃素通過清除自由基、抑制脂質過氧化反應發揮其抗氧化活性[11]，田七中的三七總皂苷抑制脂質過氧化反應[12]，靈芝的主要活性成分靈芝多糖、澤瀉總提物、山楂提取物均具有抗氧化作用[13-15]。

表3 大鼠肝組織細胞漿Nrf2、Bach1蛋白的平均光密度值比較（± s）

表3 大鼠肝組織細胞漿Nrf2、Bach1蛋白的平均光密度值比較（± s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n Nrf2-A Bach1-A正常組 8 0.171±0.024 0.190±0.011模型組 8 0.248±0.015▲▲ 0.149±0.010▲▲水飛薊素組 8 0.194±0.021** 0.204±0.021**虎金丸組 8 0.198±0.024** 0.201±0.006**

圖2 大鼠肝組織細胞漿Nrf2、Bach1蛋白的表達（200倍）

CCl4是最經典和廣泛應用的肝毒性物質，一般認為CCl4在肝細胞內經微粒體酶活化生成自由基，啟動脂質過氧化，造成肝損傷與纖維化[16]。從Masson染色結果來看，模型大鼠肝臟組織出現結構破壞、肝索紊亂、膠原纖維增生與假小葉等肝纖維化現象，而虎金丸能改善肝纖維化，降低膠原纖維面密度。

機體受到氧化應激損傷后，細胞漿中Bach1核移位進入細胞核內和Nrf2競爭ARE，Nrf2出核降解，細胞漿中Nrf2水平增加，抗氧化酶的表達水平下降。抗氧化處理時，細胞漿中Nrf2進入細胞核，與抗氧化反應元件（ARE）結合，上調抗氧化酶的表達，Bach1的核移出，細胞漿中Bach1水平增加[17-18]。實驗表明，模型組肝細胞組織勻漿中的Nrf2表達顯著高于正常組，Bach1則顯著低于正常組，SOD、GSH-Px等抗氧化酶的表達的水平與活性低于正常組，提示在氧化應激過程中Nrf2核移出，機體抗氧化酶水平降低。在藥物組中，抗氧化藥物的使用使機體的氧化/抗氧化失衡得到了調節，肝細胞組織勻漿中Nrf2水平回落，細胞漿中Bach1水平提高，SOD、GSH-Px等抗氧化酶的表達的水平與活性也得到了提高。這說明虎金丸可調控Nrf2/Bach1蛋白在肝細胞組織勻漿中的表達，通過核因子水平的變化調整SOD、GSHPx等抗氧化酶的含量與活性，從而達到調整氧化應激抗肝纖維化的作用。

[1]Florczyk U，Loboda A，Stachurska A，et al.Role of Nrf2 transcription factor in cellular response to oxidative stress[J].Postepy Biochem，2010，56（2）：147.

[2]Kalra S，Zhang Y，Knatko EV，et al.Oral Azathioprine Leads to HigherIncorporation of 6-Thioguanine in DNA of Skin than Liver：The protective role of the Keap1/Nrf2/ARE pathway[J].Cancer Prev Res，2011，4（10）：1665.

[3]Igarashi K，Sun J.The heme-bach1 pathway in the regulation of oxidative stress response and erythroid differentiation[J].Antioxid Redox Signal，2006，8（1-2）：107.

[4]Reichard JF，Motz GT，Puga A.Heme oxygenase-1 induction by NRF2 requires inactivation of the transcriptional repressor BACH1[J].Nucleic Acids Res，2007，35（21）：7074.

[5]黃張杰，施旭光，黃嫚婷，等.虎金顆粒對肝纖維化大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原及TIMP-1 表達的影響[J].中藥材，2013，1（36）：106.

[6]施旭光，黃兆勝，呂健，等.虎金顆粒對免疫性肝纖維化大鼠肝功能和肝纖指標的影響[J].浙江中醫藥大學學報，2010，34（1）：62.

[7]陳奇.中藥藥效研究思路與方法[M].北京：人民衛生出版社，2005：510.

[8]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].第3版.北京：人民衛生出版社，2006：1350.

[9]黃兆勝，趙珍東，羅綺珊，等.虎金顆粒抗肝纖維化的實驗研究[J].中成藥，2005，27（2）：227.

[10]曾偉成，蔡欽榕，楊輝，等.虎杖鞣質抗脂質過氧化作用研究[J].中藥藥理與臨床，2002（6）：18.

[11]田雪琪，田凱，陳朝銀，等.姜黃素類似物的抗氧化活性及其構效關系研究進展[J].云南中醫學院學報，2013（1）：94.

[12]郭潔文，鄧志軍，符永恒，等.三七總皂苷對心梗后心室重構大鼠增強抗氧化與改善心肌形態學作用[J].中山大學學報（自然科學版），2008（2）：140.

[13]付濤，姜淋潔，陳桂林，等.澤瀉湯降血脂及抗氧化作用有效部位的研究[J].時珍國醫國藥，2012（2）：266.

[14]劉佳，王勇.靈芝多糖的研究進展[J].現代藥物與臨床，2012（6）：629.

[15]李曉梅，郭曙光，康文藝.山楂提取物的體外和體內抗氧化作用[J].精細化工，2009（4）：348.

[16]陳金鋒，高家榮，姜輝，等.肝纖維化動物模型研究進展[J].安徽中醫學院學報，2012（6）：83.

[17]Gerasimos P.Sykiotis，Dirk Bohmann.Stress-activated cap’n’collar Transcription Factors in aging and human disease[J].Sci Signal，2010，3（112）：3112.

[18]王豫萍，程明亮.Nrf2-Keap1抗氧化系統與肝臟疾病[J].世界華人消化雜志，2010，18（18）：1907.