中西藥聯(lián)合對人胃癌SGC-7901/ADR細胞Bcl-2與Bax基因表達的影響

黎 敏 李翠文 侯培珍

包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化科,內蒙古包頭014010

腫瘤細胞對凋亡的耐受是多藥耐藥(MDR)的重要機制之一,Bax、BCL-2是調控凋亡的關鍵基因,是通過抑制腫瘤細胞的凋亡而導致耐藥的發(fā)生[1].筆者前期的研究發(fā)現班貞1號、TMP聯(lián)合5-FU對人胃癌SGC-7901/ADR細胞有較強逆轉作用[2]該研究試圖從細胞凋亡的角度探討其逆轉人胃癌SGC-7901/ADR細胞耐藥的機制,為胃癌MDR的治療提供新方法.

1 材料與方法

1.1 細胞系

由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院消化研究所惠贈的人胃癌耐阿霉素細胞株SGC-7901/ADR細胞.

1.2 藥物、試劑與儀器

①藥物與試劑:斑貞1號:斑蝥、女貞子、露蜂房、山茱萸按一定比例制備(內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院),原生藥含量:0.2 g/mL,4℃保存.TMP(浙江新華制藥有限公司)、RPMI1640(美國GIBCO公司產品)、5-FU(南通精華制藥有限公司產品)、新生小牛血清(賽默飛世爾生物化學制造(北京)有限公司),四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶(美國Sigma公司產品).②儀器:PCR擴增儀(美國AB公司),RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞處理于實驗兩周前培養(yǎng)于不含ADM的培養(yǎng)液中取對數生長期的SGC-7901/ADR細胞,以5X104/mL接種于6孔板上,2 mL/孔,培養(yǎng)24h后,分別在實驗孔加入等量如下試劑:A:新培養(yǎng)液(對照組),B:5-FU稀釋液(5-FU組);C:班貞1號稀釋液(班貞1號組);D:班貞1號+5-FU稀釋液(班貞1號+5-FU);E:班貞1號+5-FU+TMP稀釋液(班貞1號+5-FU+TMP);各組藥物濃度依之前MTT試驗的結果,選取對應的IC50值).繼續(xù)培養(yǎng)48h后,用PBS緩沖液沖洗1次,準備提取總mRNA.

1.3.2 RT-PCR檢測(PCR方法按照文獻提取組織RNA,)采用Trizol試劑盒提取RNA,引物均由大連寶生物工程有限公司合成,用于特異性擴增的Bcl-2基因序列的正義列引物為5-TCTCTCCC

GACATGACCGAGG-3',反義列引物為5-CCAGGAATATGCCCCGACTTC-3,Bax基因序列的正義列引物為5'-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3',反義列引物為5'-GCGTCCACCAAGAAGCTGAG-3,-action的正義列為5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3',反義列為5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3',先逆轉錄出cDNA,每個樣品反應體系25 uL,即ddH2O13.5 uL,10XPCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 ul,dNTP Mixture 2 uL,Takara Taq 1 uL,目的基因上、下游引物各0.5 uL,各樣品cDNA5 uL,滅菌蒸餾水13.5 uL.Bcl-2擴增條件:預變性94℃、2 min;變性94℃、30 s,退火45℃、30 s,延伸72℃、1 min,35個循環(huán);最后72℃、延伸8min.Bax擴增條件:50℃、2min;95℃、10min;95℃、15 s,60℃、1 min,40個循環(huán),最后72℃、延伸8 min.擴增結束后,取樣品10 uL,100 V恒壓,2%瓊脂糖電泳60 min.紫外反射透射分析儀采集電泳圖像,凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描得到各電泳帶平均光密度值,目的條帶與內參條帶光密度比值為相對光密度值(relative optical density,ROD).

1.3.3 統(tǒng)計方法所有數據均采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析,

2 結果

2.1 經不同藥物處理后SGC-7901/ADR細胞的Bcl-2、Baxm-RNA表達變化

RT-PCR檢測Bcl-2、BaxmRNA表達的變化(圖1、2)、凝膠成像分析結果(表1)顯示,5-FU組與陰性對照組相比,Bcl-2、Bax mRNA表達及Bcl-2/Bax比值無明顯差異(P>0.05).中西藥聯(lián)合組BaxmRNA表達明顯增高,Bcl-2mRNA表達及Bcl-2/Bax比值明顯降低,與陰性對照組及其他實驗組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

3 討論

研究表明,產生耐藥的原因之一是腫瘤細胞的凋亡調節(jié)失調.有核細胞在凋亡刺激信號作用下通過啟動細胞內死亡機制,經過一系列信號轉導途徑,最終發(fā)生細胞程序性變性和死亡的過程謂之細胞凋亡(apoptosis).Bcl-2基因家族在控制細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用,Bax是Bcl-2基因家族中能夠促進細胞凋亡的蛋白,Bcl-2是抑制細胞凋亡的蛋白.Bax過表達可促進細胞死亡,而Bcl-2過表達可阻斷或阻礙化療藥物誘導細胞凋亡,抑制Bax引起細胞凋亡的功能,使癌細胞對化療藥產生耐藥[3-4].因此Bcl-2/Bax的比值決定了細胞受凋亡因素刺激后的生與死[5-6].我們前期研究發(fā)現SGC-7901/ADR細胞對5-FU具有耐藥性,相對耐藥性為97.49[7],該研究結果表明5-FU組Bcl-2、Bax mRNA表達量及Bcl-2/Bax的比值與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明Bcl-2、bax蛋白參與耐藥細胞對5-FU的耐藥性,推測Bcl-2、Bax基因參與SGC-7901/ADR細胞的多藥耐藥.

斑貞1號合劑以女貞子、山茱萸為輔佐藥,以斑蝥、露蜂房為主藥,各成分按成人(60 kg)的臨床用量制備.其中斑蝥素可抑制腫瘤細胞DNA和RNA合成,具有以毒攻毒、解毒殺瘤、直接殺傷腫瘤且無骨髓抑制作用[8].女貞子能調節(jié)細胞毒性T細胞,保護致突劑誘發(fā)的突變效應和染色體損傷[9].作為一種中藥鈣離子通道阻滯劑,TMP可通過多種途徑治療腫瘤,逆轉多藥耐藥作用[10].該課題組研究證明:"斑貞1號對SGC-7901/ADR細胞存在逆轉作用[11];300 mg/L的TMP能有效提高SGC-7901/ADR細胞對5-FU的敏感性,使其相對耐藥性降至12.89,逆轉指數為8.43倍."[7]且中西聯(lián)合用藥對SGC-7901/ADR細胞的逆轉作用更為顯著[12].該研究結果顯示,SGC-7901/ADR細胞經中西藥聯(lián)合組處理后,baxmRNA表達量與斑貞1號、斑貞1號+5-FU組比較明顯增高,而Bcl-2mRNA表達量及Bcl-2/bax比值明顯降低(P<0.05),提示中西藥聯(lián)合可提高Bax的表達,抑制Bcl-2的表達,促進了SGC-7901/ADR細胞凋亡.這種凋亡可能是受到抑制凋亡基因Bcl-2表達下調和促進凋亡基因Bax表達上調的調節(jié),進一步證實其對耐藥細胞的顯著逆轉作用.關于體外試驗結果能否在體內發(fā)揮相同的作用,則有待進一步研究證明.

表1 SGC-7901/ADR細胞經不同藥物處理后Bcl-2、Bax的表達及Bcl-2/Bax mRNA

圖1 SGC-7901/ADM細胞經不同藥物處理后Bax mRNA表達

圖2 SGC-7901/ADM細胞經不同藥物處理后Bcl-2 mRNA表達

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