響應面法優化微膠囊固定化粘紅酵母生產L-苯丙氨酸的工藝條件

周 林,羅世翊

(1.上海科元燃化工程設計有限公司,上海200235; 2.廈門大學化學工程與生物工程系,福建廈門361005)

響應面法優化微膠囊固定化粘紅酵母生產L-苯丙氨酸的工藝條件

周 林1,羅世翊2

(1.上海科元燃化工程設計有限公司,上海200235; 2.廈門大學化學工程與生物工程系,福建廈門361005)

以微膠囊固定化粘紅酵母為研究對象,考察了粘紅酵母轉化反式肉桂酸(t-CA)生成L-苯丙氨酸過程中轉化體系溫度、p H值、cNH+4/ct-CA對L-苯丙氨酸積累量的影響,并通過響應面法對轉化條件進行了優化,得到最佳轉化條件為:溫度30.75℃、p H值11.58、cNH+4=4.77 mol·L-1、ct-CA=10 g·L-1,在該條件下,L-苯丙氨酸積累量為27.5 g· L-1。

微膠囊;粘紅酵母;L-苯丙氨酸;響應面法;優化

L-苯丙氨酸(L-Phe)是具有生理活性的芳香族氨基酸,是人和動物必需的氨基酸之一。近年來,L-Phe在醫藥領域的應用越來越被人們所重視,需求量增長了近30%,未來幾年對高純度L-Phe的需求可能還會有爆發性的增長。

L-Phe的生產方法主要是發酵法,基于先進的基因工程育種及膜分離技術,利用糖質原料直接發酵生產[1]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)逆向催化法生產LPhe,工藝路線簡單、雜酸量低、產物回收率高,可以滿足醫藥行業對高純度L-Phe的需求,不足之處在于PAL游離細胞處在高p H值、高NH+4濃度、高離子強度的反應體系中容易失活[2]。如何提高PAL在反應體系中的活性是該法生產L-Phe的關鍵[3,4]。

作者在液芯CMC-ALG微膠囊固定粘紅酵母取得不錯效果的基礎上,對微膠囊固定化粘紅酵母發酵生產L-Phe的工藝條件進行優化,旨在為后續研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌種

粘紅酵母NC07。由作者在原誘變得到的粘紅酵母NC06的基礎上進一步進行γ-誘變、亞硝基胍誘變后,篩選得到。

1.2 培養基

斜面培養基(g·L-1):蛋白胨10,酵母粉10,葡萄糖10,NaCl 2,瓊脂15,KH2PO42,MgSO40.2,p H值6.5。

誘導培養基(g·L-1):蛋白胨10,酵母粉10, NaCl 5,瓊脂15,L-Phe 5,p H值6.0。

誘導液體培養基(g·L-1):蛋白胨10,酵母粉10,NaCl 5,L-Phe 5,p H值6.0。

基礎底物轉化液(g·L-1):(NH4)2SO4200,t-CA 10,CaCl22.5,蒸餾水。

1.3 方法

1.3.1 細胞增殖培養及微膠囊固定化

參照文獻[5,6]方法進行。

1.3.2 固定化細胞制備L-Phe

在25℃、p H值為10的條件下進行酶促轉化反應。向50 m L三角瓶中加入基礎底物轉化液20 m L,充N2,160 r·min-1下振蕩反應6 h[7-9];然后向三角瓶中添加60 mg反式肉桂酸(t-CA)粉末,充N2,160 r ·min-1下振蕩反應6 h;反應結束后,再添加60 mg t-CA粉末,充N2,160 r·min-1下振蕩反應6 h,如此重復共進行10批次反應。反應結束后,離心收集轉化液,測L-Phe含量。

1.3.3 L-Phe含量TLC檢測

取轉化液上清液以GF254硅膠薄層板(厚度0.20～0.25 mm)進行點樣分析。展開劑為正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1),Rf=0.52,展距15 cm,展開6～7 h后,層析板在通風櫥自然揮干溶劑后噴霧茚三酮溶液,放入105℃烘箱中顯色10 min。根據顯色板上斑點面積由標準曲線推算樣品中L-Phe含量。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 溫度對L-Phe積累量的影響

在其它條件不變的情況下,考察溫度對轉化反應的影響,結果如圖1所示。

圖1 溫度對L-Phe積累量的影響Fig.1 Effect of temperature on L-Phe yield

由圖1可知,溫度從室溫20℃逐漸升高時,L-Phe積累量明顯升高;升至30℃時,L-Phe積累量達到最大;之后隨著溫度的升高,L-Phe積累量逐漸下降。這是由于溫度過高導致轉化反應關鍵酶PAL失活,使得肉桂酸轉化生成L-Phe的速率逐漸降低。

2.1.2 p H值對L-Phe積累量的影響

在其它條件不變的情況下,考察p H值對轉化反應的影響,結果如圖2所示。

圖2 p H值對L-Phe積累量的影響Fig.2 Effect of p H value on L-Phe yield

由圖2可知,當p H值由9.0逐漸增大時,L-Phe積累量相應升高;當p H值增大至11.0時,L-Phe積累量達到最大;當p H值增大至11.5,L-Phe積累量急劇下降。這說明適當的堿性環境有利于PAL催化反應逆向進行,但是過高的p H值容易導致PAL失活,即使細胞處在微膠囊的體系中也不能承受外界過高的堿性。

根據前期實驗及文獻經驗,轉化液中t-CA的濃度不能過高,過高會存在底物抑制效應,不利于L-Phe的生成和積累,最適的t-CA濃度在10 g·L-1左右[8,9]。因此,本實驗中將t-CA濃度固定為10 g· L-1,在其它條件不變的情況下,改變的濃度,考察轉化反應中不同底物濃度比對轉化反應的影響,結果如圖3所示。

圖3 NH+4濃度對L-Phe積累量的影響Fig.1 Effect ofconcentration on L-Phe yield

2.2 響應面優化工藝條件

2.2.1 中心組合實驗設計

根據中心組合實驗設計原理,在單因素實驗的基礎上,選取轉化體系溫度(X1)、p H值(X2)、(X3)為自變量,以L-Phe的積累量(Y)為響應值,進行優化實驗,實驗因素與水平如表1所示,實驗設計與結果如表2所示。

表1 中心組合實驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of the centre composition experiment

2.2.2 回歸模型分析

利用Design Expert 7.0對表2數據進行二次多元回歸擬合,得到L-Phe積累量(Y)對自變量轉化體系溫度(X1)、p H值(X2)(X3)的二次多元回歸方程:

表2 中心組合實驗設計與結果Tab.2 Design and results of the centre composition experiment

根據回歸方程預測出的L-Phe積累量見表2。

由表2可知,預測值和實驗值比較接近,復相關系數R2=0.9293,表明近92.93%的實驗數據可以用該模型來表征。

對回歸方程進行方差分析,結果見表3。

表3 回歸方程方差分析Tab.3 Variance analysis of the regression equation

2.2.3 最佳轉化條件的確定

針對上述模型,利用Design Expert 7.0繪制出等高線圖,如圖4所示。

圖4 各因素對L-Phe積累量影響的等高線圖Fig 4 Contours of effects of the factors on L-Phe yield

由圖4可知,PAL催化反式肉桂酸生成L-Phe反應中,轉化體系溫度、p H值和濃度之間存在著一定的相互制約,它們共同影響著L-Phe的積累過程,溫度、p H值及濃度過低或者過高均不利于催化反應的進行。

同時對回歸方程求偏導數,得到最佳條件點:

X1=0.15(T=30.75℃)、X2=1.16(p H=11.58)、X3= 0.54(=4.77 mol·L-1)

在最佳工藝條件下,對微膠囊固定化粘紅酵母催化反式肉桂酸生成L-Phe過程進行了10批次驗證實驗,得到L-Phe最大積累量為27.5 g·L-1,與模型理論值基本相符。

3 結論

在單因素實驗的基礎上,采用響應面法對微膠囊固定化粘紅酵母轉化反式肉桂酸生成L-Phe的轉化條件進行了優化,得出最佳轉化條件為:溫度30.75℃、p H值11.58、=4.77 mol·L-1=10 g· L-1。在此條件下,L-Phe最大積累量為27.5 g· L-1,與模型理論值基本相符。說明所擬合模型合理、可靠,對于粘紅酵母NC07全細胞催化反式肉桂酸合成L-Phe的下一步發酵罐規模試驗有一定的指導意義。

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Optimization of Conditions for Producing L-Phenylalanine by Rhodotorula Glutinis Immobilized in Microcapsule Using Response Surface Methodology

ZHOU Lin1,LUO Shi-yi2
(1.Shanghai Keyuan Chemical&Gas Engineering Design Co.,Ltd.,Shanghai 200235,China; 2.Department of Chemical and Biochemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

Taking Rhodotorula glutinis immobilized in microcapsule as the research object,the effects of temperature,p H value,concentration and t-CA concentration on L-Phe yield using t-CA as substrate by Rhodotorula glutinis were investigated.The parameters of reaction were optimized by response surface methodology.The optimum conditions were obtained as follows:temperature was 30.75℃,p H value was 11.58,concentration was 4.77 mol·L-1,t-CA concentration was 10 g·L-1.The maximal L-Phe yield was 27.5 g· L-1under the optimum conditions.

microcapsule;Rhodotorula glutinis;L-Phe;response surface methodology(RSM);optimization

TQ 922.2

A

1672-5425(2013)05-0057-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.05.016

2013-03-06

周林(1980-),男,江蘇揚州人,工程師,主要從事生物化工工藝設計及產業化研究,E-mail:zhoulin@kyedc.cn。