植物多聚半乳糖醛酸酶研究進展

陳麗萍 韓明麗 趙 根 李艷冬

（浙江省湖州市農業科學研究院 313000）

多聚半乳糖醛酸（內切）酶（Polygalacturonase，EC，3.2.1.15， 簡稱 PG 或 endo-PG）是多聚-α-1，4-半乳糖醛酸聚糖水化酶 （poly-galacturonideglycanohydrase）的通用名，是可分解果膠或果膠酸酶類中的一種，亦稱果膠酶（pectic enzyme）或果膠解聚酶（pectin depolymerase）。PG是一種細胞壁結構蛋白，可以催化果膠分子多聚α-（1，4）-聚半乳糖醛酸的裂解，參與果膠的降解，使細胞壁結構解體，導致果實軟化。而PG的多基因家族成員在植物發育不同階段和不同組織中的表達與果實成熟、細胞分離過程（如葉和花的脫落、豆莢開裂、花粉成熟、病原物防御、植物寄主互作）有關，還與細胞伸展、發育和木質化有關。由于PG基因在果實成熟軟化中所起的作用不是很清楚，已成為國內研究的熱點與難點。

1 多聚半乳糖醛酸酶的作用方式

早在1965年，Hobson用細胞壁蛋白粗提液體外降解純化果膠的方法發現了果實軟化與PG活性的相關性，并將PG按作用方式分為內切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）、外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）和寡聚半乳糖醛酸酶（oligo-PG）。前者以內切方式水解斷裂多聚半乳糖醛酸鏈，后二者以外切方式依次從半乳糖醛酸多聚鏈或寡聚鏈的非還原端釋放出一個單體或一個二聚體。Endo-PG對底物的特異性較強，exo-PG則較弱。Tieman等應用免疫定位法檢測整個番茄果實中的PG蛋白，發現PG的積累首先出現于心皮到果實中柱的這部分組織中，其次出現于果皮組織和其輻射狀細胞的細胞壁中，在時間上PG的積累和茄紅素的積累同步，PG蛋白大多存在于細胞壁間層或初生壁，少量定位于細胞質膜上。另外，PG也在果實、葉和花脫落區，豆莢、花藥、花粉粒、花粉管及快速生長組織中被檢出，表明PG參與植物發育的許多過程。

有人認為番茄硬度下降與PG活性有密切關系，即PG含量越高，果實硬度越小，果實軟化程度越高。目前已從多種作物果實中克隆獲得了多聚半乳糖醛酸酶基因，陳儒鋼等從辣椒中分離克隆出果實多聚半乳糖醛酸酶基因CaPG，序列分析表明，該基因全長 cDNA 為 1668bp，5’編碼區為 119bp，3’編碼區為442bp，CDS長1107bp，編碼368個氨基酸，聚類分析表明該基因與番茄的親緣關系較近，該基因可能與番茄中的PG基因具有相似的作用。

2 多聚半乳糖醛酸酶的同工酶

PG已在許多植物果實中被分離純化，已經從番茄、桃、蘋果、梨、香蕉、李、杏、葡萄、草莓、鱷梨、柿、橙、番木瓜等果實中分離出了大量與果實成熟軟化相關的PG基因（NCBI數據）。番茄、香蕉和草莓都有3種不同的同工酶，番茄和香蕉是一種同工酶在行使外-PG的功能，兩種行使內-PG的功能，而草莓則相反。Tucker等在最早時研究番茄PG時發現共有2種同工酶，分別是PG1和PG2。PG1分子量較大，為115kd，等電點為8.6，熱穩定性較好，出現于果實成熟的早期階段。Brady等后又發現，隨著果實的成熟，出現2種分子量較小的同工酶，即PG2a和PG2b，分子量分別為43kd和46kd，其等電點均為9.4。以后的研究證實PG2a和PG2b是同一基因的產物，其差異只在于糖苷化的程度不同。這3種同工酶均為糖蛋白，PG蛋白的SDS變性及蛋白酶消化反應、免疫交叉反應表明了PG1是PG2a或PG2b與其它亞單位的非共價復合體。Giovannoni等證明了這3種同工酶在DNA水平上源自于同一PG基因組。PG1、PG2a和PG2b在果實成熟中出現的順序不一樣，PG1在成熟的早期占優勢，而在完全成熟中則是PG2a和PG2b占絕對優勢。β-亞基位由一單基因編碼，并且只能在果實組織中表達，其mRNA在果實成熟啟動前幾天急劇增加并達到最大含量。β-亞單位定位于果皮的細胞壁，刺激對底物的作用能力。

3 多聚半乳糖醛酸酶基因

PG是由多基因家族編碼的，Kalaitzis等在番茄衰老的葉和花中獲得3個PG cDNA，分別為TAPG1、TAPG2和TAPG4。它們間的同源性為76%～93%，但是它們與果實中PG的同源性僅為38%～41%。在果實、莖、葉柄和花藥中未發現它們的表達，而且TAPG4比TAPG1和TAPG2轉錄的早。Kristena等報道，在瓜類果實中有PG介導的果膠物質的分解，它們獲得了3個 PGcDNA， 為 MPG1、MPG2和 MPG3。 MPG1和MPG2與桃和番茄衰老區PGs有關聯，MPG3與番茄果實PG有關聯。

目前已被克隆的果實PG基因大小約7kb，包含8個內含子，其大小從99bp到953bp不等，調控基因表達的順式作用因子存在于PG基因的上游非編碼區，轉錄單位的5’末端的一個1.4kb片段直接參與了成熟特異基因的表達。所有被克隆的PG基因編碼的PG，N端都有一個疏水信號序列，引導PG蛋白進入內質網網腔和定位于細胞壁。番茄PG蛋白經歷了廣泛的共翻譯和后翻譯調節，包括疏水的N端信號序列的加工、前肽的加工、不同的糖基化和C端的加工而成。

在番茄中已確定了7個多聚半乳糖醛酸酶基因，即：TAPG1、TAPG2、TAPG3、TAPG4、TAPG5、TAPG6與TAPG7，并且在離區與果實中表達的基因并不相同。各基因家族成員分別調節不同的時空表達，不同的PG基因家族成員編碼的酶存在生物學性質上的差異，如分解特異性和基質特異性，其氨基酸順序也存在較大的差異性，如調控番茄成熟的PG氨基酸序列和甜瓜果實PG只有60%同源。但從植物克隆得到的序列來看，PG還是存在一些高度保守的區域，經過序列比對發現來自不同物種的PG基因的氨基酸序列同源性較高，含有4個保守性極強的基序（motif）： ‘S294PNTDGIH301’， ‘G318DDC321’，‘C338GPGHG343’和‘R376IK378’。 大多數半胱氨酸（Cys，C）位點具有較強的保守性，然而3個進化支中的PG蛋白還有各自的保守區域和各自保守的半胱氨酸。酶的催化功能可能歸功于這一區域高度保守的殘基。

4 多聚半乳糖醛酸酶基因表達的分子調控

目前通過分子水平調控PG基因的表達有兩種方法。一種是通過反義RNA技術對PG進行負調控。Smith等將PG cDNA 5’端的730bp片段反向插入接上CaMV35啟動子和Nos基因3’末端，構建了一個反義融合基因，將其導入Binl9后再轉入農桿菌LBA4404，用來轉化番茄莖段，在葉中和果中都發現了反義PG cDNA，其果實PG活性只有正常株的10%。Sheehy等用PG cDNA長度為1600bp的包含有PG開放閱讀框架的片段也構建了反義基因，得到的純臺體果實，成熟各階段的mRNA和PG的水平也大大降低。另一種方法是通過插入失活使PG基因不能表達。Cooley等用位點選擇性插入的方法（the siteselected insertion）在番茄PG基因中產生插入突變，這種插入突變能遺傳給后代，所用的插入誘變物為轉座子元件在得到的純臺系后代植株的果實中，PG的活性至少降低了99.9%（用粘度法表示酶活性）。這種插入突變較反義技術抑制基因的表達為優，因為插入突變可以使目標基因完全失活，多基因家族的多基因拷貝可以獨立突變，而且通過轉座子元件的切除所引起的序列改變能產生新的等位基因和表現型。Cooley等同時應用單鏈構象多態性（SSCP）發現產生切除足印等位基因（excision footprint alle1），這種切除足跡（excision footprint allel）能在含有PG信息的框架內產生一個終止密碼子，從而使純臺型的果實中PG活性顯著降低。這樣在PG中就不含轉基因物質，應用這種方法進行植物基因工程改造具有極高的商業價值。

5 多聚半乳糖醛酸酶與植物激素的關系

果實采收后仍是一個活的有機體，有機體內細胞之間及細胞內各細胞器之間相互聯系是其生命活動必不可少的條件。這些聯系是通過各種信使系統來完成的，植物激素是細胞之間的第一信使，它在果實衰老進程中起著重要的調控作用。

5.1 乙烯對多聚半乳糖醛酸酶的影響

乙烯是一種成熟衰老激素，它在果實的采后成熟、衰老進程中起重要的調控作用。許多研究結果表明，PG基因的表達是受乙烯調控的，乙烯可以誘導綠熟番茄PGmRNA的積累。在不能正常成熟、乙烯合成受阻的突變體番茄Nr中，PGmRNA和PG酶的水平極低，乙烯合成抑制劑也可以抑制PGmRNA的積累；番茄中E4和E8基因是受乙烯調控的，其啟動子中具有乙烯應答元件，而PG基因的啟動子也具有與這些乙烯應答元件相似的序列。但在反義ACC和反義EFE轉基因番茄的果實中，即使乙烯合成受到抑制，PGmRNA仍大量積累，但PG酶不會積累，表明mRNA的轉錄不受乙烯調控，乙烯只是控制PGmRNA的翻譯和多肽的穩定性。Theologis等認為，與成熟相關基因的表達受兩個獨立的途徑調控：一種不依賴乙烯，受階段調控；另一種依賴乙烯，PGmRNA的轉錄不需乙烯，而PG的翻譯是受乙烯調控的。

5.2 其它幾種植物激素

在果實成熟衰老過程中，ABA也起著重要的調控作用。周玉嬋等用5mg/L ABA處理芒果果實，貯藏期間果實的PG酶活性增高，軟化加快，ABA處理可能直接促進了PG酶活性的增加。外源ABA處理能夠刺激越變前果實的乙烯生成，表明內源或外源ABA也可能間接地發揮著乙烯的作用，促進果實成熟軟化。

多胺對PG酶活性也有一定影響。蘋果經多胺處理后，PG酶活性被顯著地抑制，硬度增加，然后緩慢下降，其下降進程明顯減慢，其中以精胺處理的抑制效果最為明顯。芒果經多胺處理也得到了同樣的結果。多胺和乙烯相互競爭共同的前體物質SAM，多胺延緩果實的后熟軟化很可能是通過抑制乙烯合成而間接抑制PG酶的活性來實現的。生長素、赤霉素和細胞分裂素對PG酶活性的調控作用研究很多。芒果經5mg/L GA處理后，貯藏期間PG酶活性峰比對照推遲3d出現，且峰值較低，果實的成熟軟化受阻。

6 多聚半乳糖醛酸酶功能的多樣性

PG蛋白于35年前被首次分離并被認為參與植物發育許多階段的果膠降解，尤其是那些需要細胞分化的階段。雖然PG參與植物發育的許多過程，但多數研究集中在果實成熟、離層區和花粉上。

6.1 與果膠的降解的關系

果膠是植物細胞壁的主要成分之一，主要存在于中膠層，初生壁中也有一部分，它與半纖維素一起組成共同伸展的網絡狀結構，纖維素微纖絲鑲嵌在其中，這是Carpita等提出的植物初生壁模型，果膠分子的主要特征是由α-（1、4）連接的D-半乳糖醛酸的羧基發生了甲基酯化，有的在線狀主鏈上插入一些鼠李糖單位，這些鼠李糖殘基上常常由富含阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的側鏈。果膠網絡結構發生系統性分解，因此果膠代謝在植物發育過程中具有重要的作用。

果實的軟化是細胞分離的結果。細胞分離是由胞間層結構改變、細胞壁總體結構破壞以及胞壁物質降解引起的。在果實的軟化期間果膠和半纖維素都發生了溶解和去聚化，被認為與細胞壁的松懈及降解有關。PGs在細胞壁結構的改變中起重要作用，它可以催化果膠分子番茄果實中α-（1、4）-聚半乳糖醛酸的裂解，從而參與果膠的降解，促進果實軟化，有以下幾個方面的證據。果實的軟化進程與PGs活性增高一致。許多果實在成熟軟化過程中PGs活性都很高，這表明了果實的軟化和果膠的降解呈很好的相關性；在體外實驗中，PGs能直接水解未成熟果實中分離得到的細胞壁材料；未成熟果實的果皮組織用PG酶液處理時，其超微結構的變化與成熟時一樣；果實不能正常成熟和軟化的突變體（rin，nor）都缺乏PG。雖然PG在果實的軟化中起重要作用，但許多實驗表明，PGs對于果實成熟軟化并不是必要的。

6.2 與器官脫落的關系

在植物生長發育過程中，器官都會經歷程序性衰老，也會從親本上脫落下來。脫落受發育程序控制器官分離斷裂，是細胞壁和中膠層在離層處破裂的結果。在產生離層過程中，果膠被溶解，中間層膨大、開孔并消失，微纖絲網絡與器官分開。細胞壁降解酶系統是導致植物離區細胞發生分離的主要原因，其中的PG是植物離區重要水解酶之一，其活性的升高與離區脫落進程中強度的降低相一致，并且位于細胞發生分離的部位。

目前，在番茄中已明確了TAPG1、TAPG2、TAPG4和TAPG5在乙烯誘導的葉片和花柄脫落區中表達，但這些基因的表達非常復雜，現仍未明確在番茄花柄脫落中起決定作用的基因。豆莢的裂開和花藥的開裂都與脫落相似，雖然在裂開區未能肯定有PG活性，但已鑒定到到編碼假定裂開區?；磉_PG的cDNA，說明PG對豆莢的裂開起作用。

6.3 與植物授粉的關系

在許多物種（包括玉米、草本植物和大量的木本樹）的花粉中具有高水平的外切PG活性?；ǚ酃躊G通過作用于花粉管壁而加速生長，可能exo-PG通過修飾不具活性的低聚半乳糖苷信號分子成為具活性的低聚體而引導花粉管通向子房。許多基因在花粉中表達，目前已從多種植物分離到花粉專一的基因。除看家基因外，根據其在有絲分裂前或后表達分成兩類：早期基因編碼的蛋白主要是細胞骨架蛋白以及與細胞壁合成、淀粉積累有關的蛋白；而后期基因可能編碼花粉成熟和花粉管生長的蛋白。玉米、煙草、甘藍型油菜和其它物種上與PG有同源序列的cDNA已被鑒定，并被歸為后期基因。

6.4 與病害發生的關系

多聚半乳糖醛酸酶是降解植物細胞壁果膠的主要酶之一，在植物病原真菌的致病性中起著重要的作用。在許多真菌中已經證實多聚半乳糖醛酸酶的缺失或失活會導致致病力下降，但是在有些真菌中多聚半乳糖醛酸酶基因的失活并不直接影響致病力，可能與多聚半乳糖醛酸酶在真菌基因組中往往是以多基因家族存在，并且有些基因還是多拷貝的或者具有多種翻譯后修飾有關。轉反義PG基因番茄果實抗病性提高，進而提高其商品價值。轉反義PG基因番茄果實的這個性質，主要是由于PG活性被很大程度地抑制，果膠降解減慢，較好地維持了果實細胞壁結構，使病原微生物不易侵入果實，從而增強抗病性。