增強DNA 疫苗免疫原性的研究進展＊

孟俊杰 綜述 李婉宜審校

（四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院微生物學教研室，四川 成都 610041）

DNA 疫苗又稱核酸疫苗，是上世紀90年代出現(xiàn)的繼減毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗。它是將含有編碼抗原蛋白的DNA 序列的質粒載體作為疫苗，導入動物細胞后通過宿主細胞轉錄翻譯出抗原蛋白，誘導宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應答，從而使宿主獲得相應的免疫保護，以達到預防和（或）治療疾病的目的，在研究中逐漸顯示出作為第三代疫苗的優(yōu)勢。

DNA 疫苗的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾方面［1-2］：表達抗原過程與自然感染相似，以天然表位提呈，沒有表位構象的改變，能夠更好地誘發(fā)產(chǎn)生中和性抗體；不需要再在體外表達和純化蛋白質，制備簡單，成本低廉，運輸和保存方便；可以對新的病原變異迅速作出反應；可將編碼不同抗原的基因構建在同一質粒中進行融合表達，制備多價DNA 疫苗，增強免疫效果等。研究人員還發(fā)現(xiàn)［3］，利用DNA 疫苗誘導產(chǎn)生的細胞免疫可殺死腫瘤細胞，若找到細胞惡性轉化中的關鍵蛋白質，可以構建相應的疫苗打破免疫耐受或是引起免疫監(jiān)視，這為抗腫瘤研究提供了新的思路。

1 DNA 疫苗免疫機制的研究現(xiàn)狀

將含有目的基因片段的質粒導入宿主細胞以后，抗原編碼基因在宿主細胞中表達出相應抗原，并呈遞給宿主免疫系統(tǒng)，誘導機體產(chǎn)生免疫應答。這個過程與病原生物的感染過程很類似，因此宿主可同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫［4-6］。

1.1 DNA 疫苗誘導的細胞免疫

質粒被肌細胞或者周圍其他組織細胞攝取后，外源基因表達出相應的抗原蛋白，細胞中的水解酶將其降解為8～10個氨基酸的短肽。這些短肽片段在內質網(wǎng)腔中與MHCⅠ類分子的抗原結合槽結合成復合物，并經(jīng)高爾基體轉運至細胞表面。CD8+T 細胞識別抗原信號并被激活，增殖分化成為細胞毒性T 細胞（CTL），CTL釋放穿孔素和顆粒酶殺死被感染的細胞，從而阻止感染的擴散。此外，CTL 還可通過產(chǎn)生細胞因子等非溶細胞機制來抑制病毒。也有人認為DNA 疫苗進入機體后，肌細胞和抗原提呈細胞均會被轉染，使CD4+與CD8+T 細胞同時被激活從而產(chǎn)生免疫應答［7］。

1.2 DNA 疫苗誘導的體液免疫

激活B細胞需要分泌性和外源性抗原的刺激，因而抗原進入細胞表面或間隙是被B細胞識別的前提。研究表明［7］，在抗原蛋白誘發(fā)特異性抗體產(chǎn)生的過程中，完整異源抗原展示和胞外釋放起了關鍵作用。Davis［8］等根據(jù)DNA 疫苗再次免疫后的反應程度、范圍和破壞程度推測，抗體的產(chǎn)生可能與CTL 導致細胞溶解釋放抗原有關。抗原蛋白被B淋巴細胞識別后，啟動受體介導的內吞作用，最終抗原經(jīng)水解成為免疫原性多肽，與MHCⅡ類分子結合后表達于細胞表面，激活CD4+T 細胞，并分化為Th細胞，產(chǎn)生大量細胞因子。在細胞因子的作用下。B細胞進一步活化、增殖、分化為漿細胞，開始合成并分泌抗體。

2 DNA 疫苗的優(yōu)化

雖然DNA 疫苗具有減毒疫苗、滅活疫苗等無法相比的優(yōu)點，但DNA 疫苗的動物試驗研究表明，DNA 疫苗在小動物試驗中獲得了較好的免疫效果，可誘導機體產(chǎn)生較高的特異性抗體，對大動物而言，DNA 疫苗的免疫效果并不理想［9］。因此，使DNA 疫苗能在人體內誘導出較為理想的免疫反應是目前DNA 疫苗研發(fā)的重點。

2.1 DNA 序列的優(yōu)化

在DNA 疫苗的構建中，通常選擇病原體的結構蛋白和保守蛋白編碼基因作為靶基因序列誘導保護性免疫應答，以避免病毒變異產(chǎn)生免疫逃逸。Billaut-Mu lot［10］使用能夠編碼HIV-1Nef的DNA 序列對小鼠進行初次免疫，再用HIV-1Nef蛋白加強免疫，結果顯示免疫后小鼠產(chǎn)生了較強的體液和細胞免疫反應，對HIV 入侵有良好的保護作用。除此之外，對于易變異或者有較多血清型的病原體而言，多表位基因疫苗也是一種有效的應對手段。使用抗原表位做免疫原，可被有多種遺傳背景的MHC分子識別、結合，從而獲得高效的呈遞。2006年，郭研等人［11］將從HBV 表面包膜蛋白和核心抗原中篩選出的一組抗原表位進行組合，構建了目的基因片斷作為乙型肝炎特異的DNA 疫苗，用該疫苗免疫HLA-A2轉基因小鼠，在小鼠體內誘導了很強的特異性T 細胞反應。目的基因的選擇是DNA 疫苗能否獲得良好免疫原性的關鍵，通過核酸序列的優(yōu)化可使DNA 疫苗的免疫效果得到明顯提高。

2.2 佐劑的優(yōu)化

2.2.1 細胞因子佐劑

細胞因子是在機體免疫系統(tǒng)受到刺激時，參與免疫應答的細胞產(chǎn)生的小分子蛋白質，具有免疫調節(jié)的功能。使用細胞因子作為佐劑可增強疫苗的效果。白細胞介素2（IL-2）可促進T細胞生長分化，促進B細胞分泌抗體，增強NK 和CTL 的殺傷能力，可以作為一種天然免疫佐劑來使用。Kim 等［12］用編碼HIV env／rev、SIV／pol蛋白的DNA 疫苗和含有IL-2基因的質粒共同免疫恒河猴，結果顯示T 細胞介導的免疫效應得到了顯著增強。沈肖方等［13］構建出以IL-2為佐劑的乙肝病毒前表面抗原（Pres1Ag）的真核表達載體，用基因槍免疫正常小鼠和HBV 轉基因小鼠，結果顯示80%的小鼠產(chǎn)生了抗乙肝病毒前表面抗原抗體，HBV DNA 量下降，20%的小鼠乙肝表面抗原轉陰，說明此疫苗可部分打破小鼠機體的免疫耐受。干擾素（IFN）是由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子，具有影響細胞生長，以及分化、調節(jié)免疫功能等多種生物活性，也是一種比較常用的細胞因子佐劑。Guo 等［14］將干擾素基因和弓形蟲抗原DNA 用肌肉注射法免疫小鼠兩次，每次100μg，間隔2周，與單獨注射抗原DNA 的對照組相比，實驗組T 淋巴細胞和NK細胞的活性都顯著增加，IgG 抗體滴度也得到明顯提高。

2.2.2 CpG 佐劑

CpG 是以未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（CpG）為核心的回文序列，5′端為2個嘌呤，3′端為2個嘧啶。研究發(fā)現(xiàn)CpG 在細菌基因組中的出現(xiàn)頻率為1／16，在脊椎動物基因組中的出現(xiàn)的頻率為1／50，并且甲基化率為80%～90%。脊椎動物的免疫系統(tǒng)正是通過識別未甲基化的CpG 而產(chǎn)生免疫反應。CpG 序列進入細胞的機制尚不清楚，多數(shù)學者認為它是通過細胞膜表面的一種非特異性受體進入細胞。Robert［15］發(fā)現(xiàn)CpG序列可與細胞表面的Toll樣受體9（TLR9）結合，直接激活B細胞、巨噬細胞等免疫細胞。CpG 還可誘導單核細胞分泌IL-12 及其它細胞因子，活化NK 細胞和IFN-γ 的分泌。Koji-ma［16］將重組有HIV 外膜蛋白基因的DNA 疫苗與CpG ODN一同接種小鼠，觀察到特異性細胞免疫應答和體液免疫應答均明顯增強。Lipford等［17］研究發(fā)現(xiàn)弱免疫原蛋白OVA 與CpG ODN 一起免疫小鼠，IgG2a的含量顯著增加了100倍，初始的CTL反應也得到增強。Weiner［18］等報道用CpG 序列的DNA作為免疫佐劑和一種淋巴瘤抗原共同免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)免疫后的小鼠能夠抵抗攻毒實驗，而且CpG 佐劑的毒性遠低于完全福氏佐劑。

3 接種方式的優(yōu)化

目前，核酸疫苗的主要免疫接種途徑有肌肉注射、粘膜表面涂布、基因槍及腹腔注射等。

3.1 肌肉注射

肌肉被認為是最有效攝取外源基因的組織，肌肉注射也是目前應用最廣泛的免疫方式［19-20］。肌細胞可以通過T 小管或溝隙攝取外源DNA 分子，能夠長期表達外源基因，引起MHCI型免疫反應，并且肌細胞的DNA 表達能力強于其他細胞［21-23］。但由于肌肉中缺少巨噬細胞等抗原提呈細胞，其抗原提呈能力差，注入的疫苗載體轉染率偏低。因此，肌肉接種獲得的免疫力通常隨免疫次數(shù)逐漸增加。

3.2 粘膜免疫

粘膜是大多數(shù)病原體入侵的場所，粘膜抗感染保護作用的產(chǎn)生依賴于粘膜局部和系統(tǒng)的免疫反應。粘膜相關性淋巴樣組織（Mucosa-associated lymphoid tissue，MALT）是機體免疫系統(tǒng)重要的組成部分，它作為機體的防御屏障，能夠保護機體免受外源性分子的損害。當MALT 接觸大量外源抗原時往往會選擇適宜的效應機制調，以避免過強的免疫反應造成自身組織的損傷。粘膜免疫不僅誘導粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生sIgA，還可以誘導全身特異性免疫，與其他途徑相比，其免疫效果明顯增強，副作用也較小。

粘膜免疫途徑主要包括滴鼻，吸入，口服，直腸給藥等，這種非侵入的免疫方式操作簡便，無創(chuàng)傷，用藥安全。近年來，粘膜免疫途徑逐漸引起人們的重視。目前很多核酸疫苗如編碼流感病毒血凝素的核酸疫苗、編碼HIV-1包膜糖蛋白的核酸疫苗等經(jīng)常直接通過鼻腔或陰道途徑進行粘膜免疫［24］。Fenne-lly等［25］以減毒鼠傷寒桿菌作為載體將編碼李斯特菌ActA 和溶胞素的兩種基因通過口服免疫小鼠后誘導產(chǎn)生了顯著的抗李斯特菌的細胞免疫和體液免疫反應。

3.3 基因槍

又稱微彈轟擊法，是指將含有目標基因的質粒包裹在金或鎢顆粒上，利用高壓加速裝置將顆粒直接射入靶細胞內，從而實現(xiàn)基因轉移［26］。該方法可迅速方便地轉移基因，且不論細胞處于靜止期還是分裂期均可進行基因轉移。與肌肉注射法相比，基因槍所需DNA 量要少得多。Fynan等［27］用基因槍法將甲型流感病毒的DNA 疫苗免疫小鼠，對比發(fā)現(xiàn)僅用0.4μg的DNA 免疫2次即可使90%的小鼠抵抗隨后的病毒攻擊，而肌內注射則需要100μg的劑量。沈肖方［12］等用基因槍肌注人IL-2和乙肝病毒前表面抗原的真核表達載體，與正常肌肉注射和皮下注射相比，100%小鼠在第4～6周測到了抗乙肝病毒前表面抗原抗體，且該抗體持續(xù)了10周左右，所需質粒量也僅為后者的1／10。但是由于基因槍對設備要求比較高而沒有在實驗中得到廣泛運用。

3.4 腹腔注射

腹腔內有大量巨噬細胞，注入疫苗后可以迅速引起免疫應答，但是由于應答維持時間較短，轉染效率低，獲得的免疫保護效果比較差。

3.5 多途徑聯(lián)合免疫

研究表明［5］，多種途徑聯(lián)合免疫獲得的免疫效果大于僅使用一種途徑。如用疫苗進行初次免疫，重組病毒苗二次免疫，亞單位疫苗三次免疫可誘導機體產(chǎn)生高滴度抗體。注射疫苗之前，先用蔗糖溶液對接種部位進行預處理也能提高免疫應答水平。Fynan等［27］比較了甲型流感病毒DNA 疫苗經(jīng)不同途徑接種的免疫效果和保護率，結果無論是小鼠還是雞，其免疫效果均以多種途徑聯(lián)合免疫為最好。

4 結語

DNA 疫苗是新型疫苗的發(fā)展趨勢，眾多研究表明流感病毒DNA 疫苗的免疫效果良好，其保護效果不遜于傳統(tǒng)滅活疫苗。DNA 疫苗不僅有希望為現(xiàn)今難以治愈的感染性疾病提供有效的免疫保護，也可能在抗腫瘤方面發(fā)揮獨特的作用。目前DNA 疫苗的潛在應用性得到廣泛認可，美國已批準瘧疾核酸疫苗的生產(chǎn)。雖然很多DNA 疫苗還處在實驗室研究和Ⅰ期臨床實驗階段，距離應用于臨床還有漫長而艱難的道路，然而隨著對疫苗的進一步研究，核酸疫苗將成為人類與感染性疾病及腫瘤抗爭的重要武器。

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