MicroRNA與乳腺癌進展及耐藥性的作用研究

劉振茹 周黎明

（四川大學華西基礎醫學與法醫學院藥理教研室，四川 成都610041）

1 miRNA分子概述

miRNA作為一類特殊的內生性非編碼小RNA，長度約為21－25個核苷酸，在多種生物中高度保守，可在轉錄后水平調控靶基因的表達。由于miRNA常以基因簇的形式存在，可存在于基因間隔區，或位于較大的非編碼RNA分子內部，并且能夠調節處于內含子區域的基因轉錄，因此，其對基因表達的調節作用也非常復雜［1］。miRNA的成熟，涉及到在胞核及胞質中的加工過程。首先在細胞核內，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下生成pri－miRNA，經轉錄后修飾，增加5＇－端帽結構和3＇－端尾結構，然后在核酸內切酶Drosha和輔助因子DGCR8／Pasha的作用下，形成約70nt，具有莖環結構的miRNA前體pre－miRNA［2］。在核膜轉運蛋白Exp5的協助下，從核內轉運到胞質中，在胞質內經Dicer酶進一步加工后形成miRNA。

在細胞質中，成熟的miRNA可與RNA誘導的沉默復合體（RISC）整合，從而形成miRNA－RISC復合體，該復合體通過與靶mRNA的3＇－UTR區結合，裂解或抑制靶mRNA的翻譯過程，從而誘導基因沉默。盡管miRNA誘導的基因沉默通常發生在靶mRNA的3＇－UTR區，但新的研究發現，miRNA可通過位于蛋白編碼序列的種子序列及5＇－UTR區而調節翻譯過程［3］。除此之外，一些非常規少見的關于miRNA上調靶miRNA的翻譯也有報道。miRNA對mRNA翻譯調節作用的復雜性，這也充分說明了其對基因組翻譯調節的作用具有多重機制。

2 乳腺癌中異常表達的miRNA

miRNA已被證實與腫瘤的多種生物學特性具有相關性，包括增殖、分化及凋亡等過程紊亂。關于腫瘤相關miRNA表達譜的研究證實，位于脆性位點或擴增區的miRNA常異常表達，提示其可能參與腫瘤發生，從而作為腫瘤的生物標記物。

2.1 促進乳腺癌發生的miRNA

促癌基因miRNA在腫瘤中常上調表達，腫瘤抑制基因、細胞周期調節基因及利于疾病發生的其它相關基因是其潛在的作用靶點［4］。通過對miRNA表達譜的研究發現，miR－155在乳腺癌中過表達，并且在乳腺癌細胞株中過表達miR－155，可以促進細胞增殖及細胞集落形成，其功能的發揮通過抑制細胞信號因子1（SOCS1，而SOCS1作為腫瘤抑制因子可負向調控JAK／STAT信號通路［5］。Volinia等［6］發現，miR－21在多種實體腫瘤中過表達，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結腸癌等，提示其對腫瘤的作用可能具有普遍性。隨后的研究證實，多種抑癌基因PTEN、PDCD4、TPM1是其作用靶點，可以介導細胞發生凋亡［7］。細胞轉錄因子ZBTB10／RINZF是一種調控細胞周期的特殊轉錄因子蛋白（SPl）的抑制物，而miR－27作為一種腫瘤癌基因，通過調節ZBTB10表達，從而使SPl蛋白過度表達，引起細胞癌變，miR－27也可使SP2和SP3過度表達，同樣具有引起細胞癌變的作用［8］。

2.2 抑制乳腺癌發生的miRNA

抑癌基因miRNA在腫瘤中常下調表達或缺失，其作用的靶點為一些致癌基因。ErbB酪氨酸激酶受體家族對細胞的增殖及存活發揮重要作用，HER2／neu和HER3在乳腺癌中高表達，并且與乳腺癌預后不良相關，Scott等［9］研究發現，miR－125a和miR－125b可以抑制HER2和HER3的表達，并且在體外實驗中，過表達miR－125a和miR－125b可以在轉錄及翻譯水平降低HER2和HER3的表達，減少細胞增殖、侵襲及轉移的能力，從而降低其惡性表型。研究還發現，miR－205在正常的乳腺上皮干細胞中過表達，并且在乳腺癌細胞系中以HER3為作用靶點，因此，在惡性程度較高的乳腺癌細胞中可發揮腫瘤抑制作用［10］。Cascio等［11］通過模擬 MCF－7乳腺癌細胞低氧環境，發現miR－20b能夠通過調節 HIF－1（低氧誘導因子1）及STAT 3（信號轉導及轉錄激活子3）通路，下調VEGF的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖，起到抑癌基因的作用。

2.3 雌激素受體（ER）與 miRNA

雌激素受體（ER）的狀態常作為乳腺癌重要的預后標志之一，通過對miRNA的表達譜研究發現，在ER陰性乳腺癌細胞中miR－206高表達，而在ER陽性細胞中則成相反狀況。隨后的研究證實 miR－206通過3＇－UTR區調節ERα的表達。將miR－206轉染至雌激素依賴性細胞系，對細胞的增長抑制作用呈現出劑量和時間依賴性［12］。同樣，miR－221／222也可直接調節ERα的表達，研究還發現ERα和 miR－221／222構成負反饋環路，ERα可通過捕獲轉錄共阻遏物結合到miR－221／222位點對其進行負向調控［13］。與之相似的，miR－22可負向調控ERα，體外實驗證實使用miR－22處理ERα陽性乳腺癌細胞可抑制細胞的增殖［14］。 而 Pedro de Souza Rocha Simonini等［14］提 出miR－375在ERα陽性乳腺癌細胞存在高表達，與以往的研究不同，作者首次提出miR－375與ERα構成正反饋環路，并下調RASD1mRNA表達水平，促進乳腺癌細胞生長。基于以上研究，有假設提出，一些miRNA可能促使ER陽性細胞向ER陰性細胞的轉變。

3 乳腺癌生物學行為相關的miRNA

腫瘤的侵襲和轉移所致的并發癥是惡性腫瘤死亡的重要原因，而腫瘤的轉移是多步驟、復雜的生物學過程，近年研究發現，miRNA可調節乳腺癌轉移的多個關鍵步驟，如上皮細胞間質轉變（EMT）、凋亡及血管生成等過程。EMT是上皮細胞獲得遷移能力的重要方式，miR－200家族及miR－205可通過作用于Zeb1及Zeb2而調節EMT過程，miR－205可抑制 MCF－7增殖，并可抑制 MDA－MB－231細胞的侵襲轉移能力［15］。多數研究也證實miR－200家族可抑制體外培養細胞的侵襲能力［16］。miR－9的作用靶點為E－鈣粘蛋白，E－鈣粘蛋白表達缺失常伴隨有EMT的發生，進一步研究發現，MYC及MYCN可直接調節miR－9，過表達miR－9，促進細胞增殖，侵襲，并誘導移植瘤的血管生成。Valastyan等［17］研究證實，miR－31在正常乳腺細胞中表達，而在轉移性乳腺癌細胞中表達缺失，過表達miR－31可以抑制轉移發生的多個步驟，與之相反，在非轉移性乳腺癌細胞中使miR－31表達缺失，則可增加細胞轉移的能力。隨后的研究發現，miR－31可作用其靶點ITGA5、RDX及RhoA，當靶基因表達水平下降時，患者的生存期延長。Zhu等［18］通過對2種乳腺癌模型（MCF－7及 MDA－MB－231）的對比研究，發現與MCF－7乳腺癌模型不同的是，miR－21并不影響 MDA－MB－231乳腺癌模型中原發腫瘤的生長，但能夠促進細胞的侵襲以及肺轉移，這可能是通過下調其它的腫瘤抑制因子而發揮作用。MUC1是由muc1基因表達的一種高糖基化蛋白。它參與上皮更新及分化，在維持上皮完整性和腫瘤的發生與轉移等方面都起到重要的作用。Sachdeva等［19］研究表明miR－145直接調節muc1基因的表達，從而下調β連環蛋白、細胞周期素D和粘鈣蛋白，對乳腺癌細胞侵襲及轉移起到抑制作用，因此，上調miR－145的表達可以減少乳腺癌細胞的轉移。最近，Baffa等［20］通過miRNA微陣列分析43對原發腫瘤及淋巴結轉移瘤中異常表達的miRNA，分析顯示32個miRNA差異表達，其中包括在轉移瘤中明顯上調的miR－10b和miR－21以及下調的miR－141、miR－200b、miR－200c和 miR－205等。

綜上，miRNA可通過上調或下調基因的表達在腫瘤轉移的多個步驟發揮作用，從而成為腫瘤預后評價及抑制腫瘤轉移的治療靶點，通過抑制促轉移miRNA或增加抑制轉移miRNA的表達，從而在治療乳腺癌轉移方面提供新的策略。

4 乳腺癌多藥耐藥相關的miRNA

腫瘤的多藥耐藥（MDR）是目前抗腫瘤治療中面臨的嚴重問題，MDR的出現使腫瘤不僅對一種抗腫瘤藥物產生耐藥，而且對其它化學結構及作用機制不同的多種化療藥物產生交叉，廣譜的耐藥性。乳腺癌多藥耐藥主要與細胞相關蛋白、雌激素受體及信號通路等改變有關，隨著對miRNA研究的深入，發現其在MDR的產生中發揮著重要的作用。

4.1 miRNA調控乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）

乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）與乳腺癌的多藥耐藥關系密切，通過對其進行基因敲除或化學抑制，發現BCRP可以限制腫瘤細胞內的藥物堆積，而許多miRNA可以對其進行調控。Li等［21］研究發現乳腺癌耐藥細胞株 MCF－7／MX100，轉染 miR－328或miR－519c后，腫瘤細胞內米托蒽醌顯著增加，進一步研究證實，miR－328和 miR－519c可通過靶向作用于BCRP的3＇－UTR區，從而下調BCRP的表達，而轉染miR－520h后，BCRP的表達量并未發生明顯改變。而Pelletier等［22］研究證實某些miRNA可以干擾BCRP的3＇－UTR區多態性，從而改變其與3＇－UTR的結合能力，影響乳腺癌耐藥性的產生。

4.2 miRNA調控P糖蛋白（P－gp）

P糖蛋白（P－gp）過度表達導致藥物外排，是參與乳腺癌多藥耐藥性產生的經典機制之一。Kovalchuk等［23］研究發現，耐阿霉素的乳腺癌細胞 MCF－7／DOX中miR－451表達水平下降，并且調節miR－451活性的酶Dicer及Argonaute2表達失調，而MDR1及P－gp的表達增加，轉染miR－451后，可增強耐藥細胞對阿霉素的敏感性，提示miR－451能負向調節P－gp的表達，從而恢復耐藥細胞的敏感性。而zhu等［24］研究與之相反，miR－451在腫瘤細胞中的表達具有差異性，miR－451上調P－gp的mRNA及蛋白的表達，從而增加卵巢癌細胞A2780的耐藥性。

4.3 miRNA調控多藥耐藥相關蛋白（MRP）

MRP對乳腺癌多藥耐藥性也很重要，Liang等［25］研究證實，miR－326可參與調控MRP的表達，從而參與乳腺癌的多藥耐藥，該研究通過芯片篩查了MRP高表達的乳腺癌耐藥細胞株 MCF－7／VP及親本細胞 MCF－7，發現多種miRNA表達具有差異性，如 miR－326、miR－429、miR－187、miR－7、miR－92、miR197等，其中miR－326顯著低表達，進一步研究發現miR－326可作用于 MRP mRNA的3＇－UTR區，轉染 miR－326可提高 MCF－7／VP對化療藥物的敏感性。Pogribny等［26］在探討耐藥乳腺癌細胞MCF－7／CDDP及親本細胞 MCF－7，是否存在相應的miRNA能夠針對藥物輸出泵的潛在靶點，該研究發現miR－7及miR－345能夠直接作用于 MRP1基因的3＇－UTR區，將 miR－7及 miR－345轉染到耐藥細胞株 MCF－7／CDDP，可以使 MRP1含量顯著下降，明顯提高對順鉑的敏感性。

4.4 miRNA參與乳腺癌多藥耐藥的其它機制

14－3－3ζ蛋白是14－3－3蛋白家族的一員，可與多種靶蛋白結合，通過與配體蛋白相互作用，對細胞周期，細胞凋亡和多種信號轉導發揮調控作用。Anna等［27］研究發現14－3－3ζ在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞 MCF－7（TamR）中表達上調，而miR－451顯著下調，并且經他莫昔芬處理后，對14－3－3ζ上調及miR－451下調的作用呈現時間和劑量依賴性，進一步使用熒光素酶報告基因證實miR－451可靶向作用于14－3－3ζ的3＇－UTR區，轉染 miR－451后，可通過下調14－3－3ζ、p－MAPK及p－AKT等途徑，恢復耐藥細胞的敏感性。Zhao等［28］研究發現miR－221和miR－222可直接調節ERα，其在ER陽性乳腺癌細胞中表達時，可降低細胞對他莫昔芬的敏感性。Miller等［29］研究也發現在他莫昔芬耐藥的MCF－7細胞系中miR－221和miR－222過表達，并且和HER2＋的乳腺腫瘤的內分泌治療耐藥相關。Erik等［30］發現 miR－519c可以調節 BCRP的表達，miR－21和miR－214可作用于PTEN，從而調節PI3K／AKT信號通路。

展望

miRNA作為促癌或抑癌因子，在腫瘤的發生、發展、轉移及耐藥等方面發揮著重要的作用，特異性惡性腫瘤相關的miRNA編碼基因的發現，為腫瘤治療提供了新的策略。基于miRNA的診療手段，如利用特異性miRNA早期診斷乳腺癌，在已發生轉移或產生耐藥性的乳腺癌患者中，運用miRNA靶向治療控制腫瘤發展及逆轉耐藥性，指導術前分期及手術后化療方案的制定等，都需要對miRNA的作用靶點及機制進行詳細深入的研究。

1 Kim VN，Nam JW.Genomics of microRNA［J］.Trends Genet，2006，22（3）：165－173.

2 Lee Y，Ahn C，Han J，et al.The nuclear RNase III Drosha initates microRNA processing［J］.Nature，2003，425（6956）：415－419.

3 Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets［J］.Cell，2005，120（1）：15－20.

4 Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435（7043）：834－838.

5 Jiang S，Zhang HW，Lu MH，et al.MicroRNA－155Functions as an OncomiR in Breast Cancer by Targeting the Suppressor of Cytokine Signaling 1Gene［J］.Cancer Res，2010，70（8）：3119－3127.

6 Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（7）：2257－2261.

7 Meng F，Henson R，Wehbe－Janek H，et al.MicroRNA－21regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer［J］.Gastroenterology，2007，133（2）：647－658.

8 Abdelrahim M，Samudio I，Smith R，et al.Small inhibitory RNA duplexes for Spl mRNA bl－ock basal and eestrogen induced gene expression and cell cycle progression in MCF－7breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2002，277（32）：28815－28822.

9 Scott GK，Goga A，Bhaumik D，et al.Coordinate suppression of ERBB2and ERBB3by enforced expression of micro－RNA miR－125a or miR－125b［J］.J Biol Chem，2007，282（2）：1479－1486.

10 Greene SB，Gunaratne PH，Hammond SM，et al.A putative role for microRNA－205in mammary epithelial cell progenitors［J］.J Cell Sci，2010，123（Pt 4）：606－618.

11 Cascio S，D Andrea A，Ferla R，et al.miR－20bmodulates VEGF expression by targeting HIF－1alpha and STAT3in MCF－7breast cancer cells［J］.J Cell Physiol，2010，224（1）：242－249.

12 Kondo N，Toyama T，Sugiura H，et al.miR－206Expression is down－regulated in estrogen receptor alpha－positive human breast cancer［J］.Cancer Res，2008，68（13）：5004－5008.

13 Di Leva G，Gasparini P，Piovan C，et al.MicroRNA Cluster 221 222and Estrogen Receptor｛alpha｝Interactions in Breast Cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2010，102（10）：706－721.

14 de Souza Rocha Simonini P，Breiling A，Gupta N，et al.Epigenetically deregulated microRNA－375is involved in a positive feedback loop with estrogen receptor alpha in breast cancer cells［J］.Cancer Res，2010，70（22）：9175－9184.

15 Korpal M，Lee ES，Hu G，et al.The miR－200family inhibits epithelial－mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of E－cadherin transcriptional repressors ZEB1and ZEB2［J］.J Biol Chem，2008，283（22）：14910－14914.

16 Valastyan S，Benaich N，Chang A，et al.Concomitant suppression of three target genes can explain the impact of a microRNA on metastasis［J］.Genes Dev，2009，23（22）：2592－2597.

17 Valastyan S，Reinhardt F，Benaich N，et al.A pleiotropically acting microRNA，miR－31，inhibits breast cancer metastasis［J］.Cell，2009，137（6）：1032－1046.

18 Zhu S，Wu H，Wu F，et al.MicroRNA－21targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis［J］.Cell Res，2008，18（3）：350－359.

19 Sachdeva M，Mo YY.MicroRNA－145Suppresses cell invasion and metastasis by directly targeting mucin 1［J］.Cancer Res，2010，70（1）：378－387.

20 Baffa R，Fassan M，Volinia S，et al.MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets［J］.J Pathol，2009，219（2）：214－221.

21 Li X，Pan YZ，Seigel GM，et al.Breast cancer resistance protein BCRP／ABCG2regulator microRNAs （has－miR－328，－519cand－520h）and their differential expression in stem like ABCG2＋cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2011，81（6）：783－792.

22 Pelletier C，Speed WC，Paranjape T，et al.Rare BRCA1haplotypes inlcuding 3＇－UTR SNPs associated with breast cancer risk［J］.Cell Cycle，2011，10（1）：90－99.

23 Kovalchuk O，Filkowski J，Meservy J，et al.Involvement of microRNA－451in resistance of the MCF－7breast cancer cells to chemotherapeutic drug doxorubicin［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（7）：2152－2159.

24 Zhu H，Wu H，Liu X，et al，Role of microRNA miR－27aand miR－451in the regulation of MDR1／P－glycoprotein expression of hunman cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，76（5）：582－588.

25 Liang Z，Wu H，Xia J，et al.Involvement of miR－326in chemotherapy resistance of breast cancer through modulating expression of multidrug resistance－associated protein 1［J］.Biochem Pharmacol，2010，79（6）：817－824.

26 Pogribny IP，Filkowski JN，Tryndyak VP，et al.Alterations of microRNAs and their targets are associated with acquired resistance of MCF－7breast cancer cells to cisplatin［J］.Int J Cancer，2010，127（8）：1785－1794.

27 Anna B，Benita S.K.Tamoxifen down－regulation of miR－451increases 14－3－3ζand promotes breast cancer cell survival and endocrine resistance［J］.Oncogene，2012，31（1）：39－47.

28 Zhao JJ，Lin J，Yang H，et al.MicroRNA－221／222negatively regulates estrogen receptor alpha and is associated with tamoxifen resistance in breast cancer［J］.J Biol Chem 2008，283（45）：31079－31086.

29 Miller TE，Ghoshal K，Ramaswamy B，et al.MicroRNA－221／222 confers tamoxifen resistance in breast cancer by targeting p27Kip1［J］.J Biol Chem，2008，283（44）：29897－29903.

30 Erik AW.Role of microRNAs in anti－cancer drug resistance［C］.MicroRNAs in Cancer Translational Research，2011，449－483.