泌尿生殖道支原體培養鑒定方法的分析

陶建萍

（廣西梧州市紅十字會醫院檢驗科 廣西 梧州 543300）

支原體是一種能獨立生活，介于細菌與病菌之間最簡單的原核生物。有80多種廣泛分布于自然界，目前已知人類支原體有十多種［1］。近年來支原體已廣泛成為非淋病泌尿生殖道感染的主要病原菌［2］，因其傳播快，范圍廣，已成為世界備受關注的公共衛生問題［3］。從十九世紀六十年代開始至今，歐美國家就從支原體的生物學特性，培養，藥敏，等方面展開了廣泛的研究。進十年來，我國對支原體的流行病學和耐藥性等方面也進行了大量的文獻報告，在這些報道中［4］－［9］發現支原體分離培養，鑒定方法均普遍 存在著一些問題［10］，其中比較多的是單憑肉湯培養顏色的變化來判斷有無支原體生長，而不是根據支原體在固體培養基上的典型菌落來判斷有無支原體，這就容易受到其他因素干擾，導致支原體培養鑒定假陽性和假陰性。本文綜合有關文獻報道就支原體生物學特性，培養特性，國內外支原體培養的方法，肉湯培養液顏色及支原體假陽性的問題進行探討。

1 常見生殖道支原體

人類生殖道支原體最常見的有解脲支原體（Uu），人型支原體（MH），生殖道支原體（MG）發酵支原體［11］。致病性較強的主要是Uu和MH。解脲支原體長居在人的泌尿生殖道黏膜，引起成人的泌尿生殖系統炎癥反應和結石，各種慢性急性婦科炎癥，男女不育癥，孕婦早產和男性慢性前列腺炎［12］。

2 生物學特性

解脲支原體（Uu）在固體培養基上菌落表面有粗顆粒，在適宜培養基中可轉呈光滑，并發育成典型的‘荷包蛋’狀菌落，不被青霉素抑制，對紅霉素高度敏感，支原體營養要求高于一般細菌，支原體在生長過程中可分解尿素。

3 支原體培養特性

支原體的特征是不具有細胞壁，能通過除菌濾器，能在人工培養基上生長，但營養條件高，培養需要供給膽固醇和新鮮酵母侵膏，同時還要添加少許雞蛋清或馬血清［13］。支原體培養基一般有三種：轉運培養基，肉湯增菌培養基和瓊脂固體培養基。

4 支原體培養及鑒定方法

追根溯源，從支原體培養的最初研究開始，支原體的鑒定就是依據瓊脂固體培養基上的典型菌落形態和生化反應，在美國支原體培養鑒定按《臨床生物手冊》［14］依據固體培養基上的固形菌落形態的生化反應鑒定支原體。國內1997年《全國臨床檢驗操作》第二版和曹三璞主編《支原體與支原體病》等國內相關權威性專業書籍中介紹支原體培養方法同樣包括肉湯增菌和轉種固體平板兩部分鑒定支原體。因此，無論國內外判斷支原體陽性結論最終建立在培養基的典型菌落。完整的支原體培養過程應有兩步，第一步肉湯增菌觀察顏色變化，第二步將增菌培養液轉瓊脂固體培養基觀察其典型菌落形態，最終準確可靠的鑒定應當依據菌落形態和有關生化鑒定。

目前國內支原體檢測方法有固體培養基培養法，血清學試驗檢測法，分子生物學方法及支原體液體培養法等。

4.1 支原體固體培養法：固體培養法是標準的支原體培養法，固體培養基中加有馬血清、0.05%新鮮酵母浸膏、0.02%酚紅和抗生素。將接種好標本的固體培養基置95%N2和5%CO2環境，35℃溫箱16－24小時培養形成細小典型的“荷包蛋”狀菌落。固體培養方法好，特異性高，但需要培養條件高，受局限性，培養基配制繁瑣，生長慢，采用濾膜易受污染［15］，同時存在所需配套設備多，技術要求高等缺點不利于臨床推廣。此方法廣泛應用于研究所、實驗室。目前國內有條件的實驗室已用法國生物梅里埃A7瓊脂平板固體培養基檢測支原體。

4.2 血清血試驗診斷：包括：①斑點免疫結合試驗。②間接血凝試驗（IHA）。③代謝試驗（MIT）。④酶聯免疫吸附試驗（ELASA）。斑點免疫結合試驗，此方法簡單，但敏感度低，可能漏檢；間接血凝試驗（IHA）、代謝試驗（MIT）、酶聯免疫吸附試驗等三種方法有較強的敏感性，缺點是操作較繁瑣費時，需要大量血清，結果不穩定，試劑不易獲得。

4.3 分子生物學方法：解脲支原體檢測的分子生物學方法包括：①聚合酶鏈反應（PCR）。②熒光PCR（FQ－PCR）。PCR用于檢測解脲支原體DNA，具有可定性和定量、敏感度高、結果比較客觀的優點，但無法提供藥敏試驗，易受其他因素影響，穩定性和特異性不足，實驗室設施要求高；熒光PCR（FQ－PCR）技術特異性和敏感性菌較高，亦存在一定假陽性，需要熒光定量測定儀，價格高，實驗室設備要求高，一般臨床實驗室開展有一定難度。支原體培養法與PCR、FQ－PCR檢測結果對比：支原體培養法的特異性100%，但敏感性低，只有71.43%；PCR的敏感性為96.43%，但特異性稍不足，為93.7%；FQ－PCR的敏感性是三種方法中最高的99.2%，特異性為99.2%。FQ－PCR技術融合了PCR的高敏感性、特異性強、準確性好；試驗周期快，且能準確定量，對早期診斷及療效的檢測有一定臨床價值，但PCR和FQ－PCR檢測需要特殊儀器和專業工作人員，較難在基層推廣。

4.4 支原體培養液法：目前國內醫院臨床試驗普遍采用支原體液體培養基進行分離和鑒定，支原體在液體中生長具有與細菌不同的特點。該檢驗方法簡單，快捷，經濟，敏感性好。其檢驗原理是依據解脲支原體能分解尿素，人型支原體能分解精氨酸，均能產氨使液體培養基變堿性。所有商品化中成品支原體培養液肉湯都依據此原理設計，在肉湯中加入酚紅指示劑，當尿素或精氨酸被分解成NH3時肉湯PH值上升，含酚紅指示劑肉湯由橘黃色變紅色判斷為Uu和MH陽性［16］。但結果易受其他因素干擾，如標本污染產尿酶細菌就會產生假陽性。常規支原體液體培養液中的抑制劑為青霉素，以抑制標本中雜菌，但抑制劑不能抑制所有微生物。一旦有其他能分解尿素和精氨酸的微生物在培養基中生長，就會導致假陽性或假陰性，僅靠肉湯顏色變化判斷支原體陽性，不客觀，肉湯顏色變化只是一種提示和初篩。在檢測標本中如果有較高比例的細菌生長，肉湯變渾濁或消耗肉湯中營養成分，造成假陽性和假陰性，影響結果的真實性［17］。建議有條件實驗室檢測解脲支原體和人型支原體，以觀察肉湯顏色變化和支原體同時固體培養鑒定最佳。

綜上所述，FQ－PCR是一種比較理想的支原體檢測方法，優于支原體液體培養法，有較大的臨床應用價值和推廣價值。FQ－PCR法特異性好，敏感性好，而且能準確定值，近年來特別在診斷新生兒痰液中解脲支原體的臨床意義較大，可觀察新生兒解脲支原體感染高低值，對診斷新生兒解脲支原體感染有臨床指導意義，但不能同時檢測支原體體外藥物敏感性，而且檢測設備要求高，基層難推廣。固體培養基培養法被普遍認為是支原體檢測的“金標準”，目前無論是國外，還是國內判斷支原體陽性的結論都是建立在固體培養基上的典型支原體菌落，該方法值得推廣。國內目前已有用法國梅里埃A7瓊脂平板固體培養基法檢測支原體的有關報道，值得普及。液體培養法操作簡單，不要特殊條件，容易在基層普及推廣，結果容易判斷，可以同時進行藥敏試驗，指導臨床合理使用抗生素，但容易受外界因素干擾，特異性較差，當標本混合有可分解脲酶的微生物液體培養基就會變紅產生假陽性和假陰性。至今沒有一種檢測技術的同時有100%的敏感性和特異性。建議醫院臨床實驗室在采用支原體液體培養時，增加細菌分離鑒定及細菌脲酶試驗，最好用固體培養法提高支原體的特異性，用液體培養法初篩并進行藥敏試驗，即可排除產脲酶細菌引起的假陽性，假陰性，又提高支原體培養的特異性和敏感性，保正結果準性，具有較好的臨床應用價值，值得臨床推廣應用。

［1］ 張道友主編.先化臨床試驗正常值手冊［M］.安徽科學技術出版社，2001：405

［2］ 王矽，宋新麗，李澤，等.泌尿生殖道感染支原體耐藥分析［J］.中華微生物和免疫學雜志，2002，22（4）：405－406

［3］ 李躍進，譚湘芳.熒光定量PCR檢測性病的結果分析［J］.實用醫技雜志，2007，6（14）：2151

［4］ 張子平，施透明，劉 等.非淋菌性尿道（宮頸）泌患者解脲支原體和人型支原體的培養分析［J］.福建醫科大學學報，2002，.34（2）：183－184

［5］ 王莉平，資捷，易輝.女性泌尿生殖道感染患者解脲支原體和人型支原體培養及耐菌性分析［J］.中華醫院感染學雜志，2007，31（5）：612－614