旋毛蟲脫氧核糖核酸酶Ⅱ的研究進展

王振普 赤峰市農牧業綜合行政執法支隊 024000

旋毛蟲病（Trichinelliasis）是一種由旋毛蟲引起的呈全球性分布的人獸共患寄生蟲病，可感染人及150 多種動物，現今該病仍有暴發流行［1］。在我國，其不但被列為三大人獸共患寄生蟲病之首（旋毛蟲病、囊蟲病及棘球蚴病），而且是肉類進出口和屠宰動物首檢和必檢的一項［2］。我國于1981年首次在廈門從豬的體內發現旋毛蟲，以后陸續在黑龍江、遼寧、福建、貴州、河南和湖北等省發現多種動物感染。

自從1835年Page 和Owen 首次發現旋毛蟲以來，人們始終在為有效快捷地診斷及預防旋毛蟲病做著不懈的努力［3］。旋毛蟲傳播途徑復雜，發育過程中不需要中間宿主，給該病的防制帶來極大的障礙。由于旋毛蟲的抗原成分極其復雜，而且不能進行體外大量培養和繁殖，這給尋找特異、敏感的診斷抗原帶來困難，用于免疫預防的強保護性抗原問題始終未得到解決。隨著分子生物學技術的迅猛發展和對旋毛蟲研究的不斷深入，使得研究旋毛蟲功能性基因成為可能。目前，對旋毛蟲侵入機體并調整肌細胞分化形成包囊的分子水平作用機制仍然知之甚微，由于新生幼蟲期是旋毛蟲包囊形成的主要時期，因此分離與鑒定旋毛蟲新生幼蟲期特異性基因，為進一步探求旋毛蟲形成包囊的分子作用機制奠定了基礎。核酸酶（nuclease）是指所有可以水解核酸中磷酸二酯鍵的酶的統稱。根據作用底物不同，可將核酸酶分為核糖核酸酶（RNase）和脫氧核糖核酸酶（DNase）；根據催化部位不同，可分為核酸外切酶(exonuclease)和核酸內切酶(endonuclease)。

哺乳動物細胞內存在多種脫氧核糖核酸內切酶，一般該類酶以Ca2+、Mg2+為輔離子，在核苷酸內部位點上裂解染色體DNA，形成特異性梯狀(ladder pattern)排列的片段，從而在細胞凋亡中發揮一定作用。目前得到鑒定和公認的核酸內切酶主要有兩種：(1)脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonu clease I，EC)，簡稱DNase I；(2)脫氧核糖核酸酶II(deoxyribonuclease II，EC)，簡稱DNase II。20世紀60年代末，首先在牛胰腺中發現DNase I(最初命名為胰DNase)，隨后在牛脾和胸腺中發現了DNase II（命名為脾酸性DNase）。兩者的主要區別是最佳pH 值和陽離子依賴程度不同。前者一般需要二價陽離子作為輔助因子，在接近中性條件下活性最高，而后者不需要二價陽離子作為輔助因子，在酸性條件下酶活性較高。

旋毛蟲的p43 基因編碼的蛋白為脫氧核糖核酸酶Ⅱ。而香港大學的KoRC 教授發現旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌物中具有很強的核酸酶活性，而偽旋毛蟲則沒有此酶活性（偽旋毛蟲是旋毛蟲中不能夠形成包囊的蟲種），并且進一步驗證了核酸酶參與了包囊形成的可能性［4］。因此，本文就旋毛蟲的脫氧核糖核酸酶研究做一綜述。

1 旋毛蟲DNaseⅡ的研究進展

郭恒等［5］用地高辛標記cDNA 探針N5 對旋毛蟲新生幼蟲(NBL)cDNA 文庫進行核酸雜交篩選，有13 種基因均為旋毛蟲未知基因序列，均含有DNase II 的保守序列。隨后利用同樣的方法又從旋毛蟲成蟲（AD）的cDNA 文庫中調取了11 條DNase II 基因。而在旋毛蟲肌幼蟲（ML）中也發現存在一種編碼DNase II 的p43 基因。目前從旋毛蟲中發現的DNase II 基因最多。旋毛蟲為何具有如此眾多的DNase II 基因，其意義和原因還不是很清楚。旋毛蟲DNase II 在進化關系上與其他物種的DNase II 也有較大的區別：旋毛蟲DNase II基因家族形成了一個獨特的分枝，而其他物種的DNase II 則在一個大的分枝內。線蟲(如C.elegans，細胞凋亡機制和RNAi 的發現均源于它)作為一種模式生物已受到廣泛的重視和利用，故對旋毛蟲DNase II 進行研究也同樣具有著非常重要的意義。DNase II 引發細胞凋亡的機理在于其對染色體DNA 進行特異性切割致使細胞發生凋亡。旋毛蟲脫氧核糖核酸酶II 沒有引起肌細胞的凋亡，而是引發了肌細胞膠原蛋白基因的異常轉錄與表達，從而有可能形成了旋毛蟲的膠原蛋白包囊。如果說旋毛蟲DNase II 以發揮切割DNA 的功能參與旋毛蟲包囊形成的話，那么可能的機制就是旋毛蟲通過一種或數種DNase II 對肌細胞的染色體DNA 進行有目標的特異性切割，切割的結果是使膠原蛋白基因得以保留而使其他基因遭到破壞，從而使膠原蛋白基因得以被大量轉錄與表達［6］。

對旋毛蟲N5 蛋白的活性中心和關鍵氨基酸殘基推測可能是正確的。證實N5 蛋白能夠被ATA抑制，在沒有鎂離子的條件下，突變產物同樣不能對DNA 進行酶切，DNaseⅡ在pH 為5.0 左右時活性最大。旋毛蟲的DNaseⅡ活性區域是JFWLVH，關鍵氨基酸是H，人的DNaseII 活性區域是DHSKW，關鍵氨基酸是H。兩個區域在不同物種都非常保守。通過對旋毛蟲N5 蛋白進行酶切實驗，證實N5具有和DNaseII 同樣的特征。

DNase II 基因也有一定的相似性［7］，可以認定p43 蛋白屬于DNaseII 家族成員。p43cDNA 與旋毛蟲新生幼蟲DNaseII 家族中的13 條基因氨基酸有較高的相似性，而與分離的旋毛蟲成蟲期DNase II家族的11 條基因也有較高的相似性。目前在旋毛蟲中發現的屬于脫氧核糖核酸酶II 的基因主要有如下幾種：肌幼蟲的p43（偽旋毛蟲為p38），成蟲的T3223 家族（代表性基因為T3223），新生幼蟲的N5 家族（代表性基因為N5 和N10）。經過基因庫的檢索與查詢，在目前已分離到DNase II 基因的38 個物種中，除旋毛蟲外任何一個物種均不具有超過4 種以上的DNase II 基因，而唯獨旋毛蟲卻擁有一個龐大的基因家族，雖然目前尚不知它們的具體功能，但很有可能與其侵襲與致病有關［8-11］。

p43 氨基酸序列中存在兩個糖基化位點，表明該p43 蛋白中存在糖基化現象。1996年Vassilatis發現抗43kDa 蛋白的抗體只有在去糖基化形式下才能識別保護性肽鏈，認為碳水化合物覆蓋了抗原決定簇某些部分，因此糖基化反應通過隱藏功能對相關抗原決定簇起作用，能構成一個免疫系統的侵襲機制［12］。p43 蛋白是用于疾病診斷和免疫的重要物質，碳水化合物是旋毛蟲的免疫顯性抗原決定簇，有關抗原決定簇或寄生蟲侵襲機制以及聚糖的作用等問題，還需進一步研究。

從進化結果來看，p43 基因與美國學者發現的p43 和p49 同源性最高，可以進一步確定這三個基因是同一個基因。同時發現p43 與新生幼蟲期的DNaseII 的同源性要比成蟲期的DNaseII 高一些。而且發現旋毛蟲的DNaseII 序列都存在于一個大的分支內，與其他物種的DNaseII 基因構成了DNaseII基因進化樹的兩個獨立的分支，其真實性和原因及意義有待進一步研究。

2 結語

旋毛蟲DNase II 不但在包囊形成過程中起重要作用，而且還具有參與細胞凋亡，阻止外源基因整合的作用。對于旋毛蟲DNase II 家族的其他功能和意義還不清楚，需進一步研究。

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