10例皮膚病患者應用分子生物學技術對病原真菌感染診斷與應用

李寶坤

遼寧中醫藥大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧沈陽 110847

在最近幾年，隨著醫學技術的不斷進步，抑制免疫類的藥物被廣泛的應用。病原真菌感染的疾病在不斷增多，所以菌種在臨床診斷和治療中也是非常重要的。真菌感染的診斷，可以以形態學為主要依據，但這些方法費時費力，并且檢測率比較低。隨著目前迅速發展的生物學技術，病原真菌生物學的特性越研究越深，本文對生物學技術對病原真菌感染診斷進行了分析和研究。隨著生命科學和滑雪的不斷發展，人們對生物體的研究進入到更深的層次，從當個的生物體發展到器官在到組織等。從細胞結果到核酸和蛋白的分子，到細胞結果到蛋白的分子水平，人們也逐漸認識到可以通過檢測分子水平的線性結果來比較不同物種，或者同種物種不同個體之間的差異。這也為生物學和醫學的每個領域提供一個更好的研究平臺，一般分子生物學技術研究有以下幾種：PCR、分子克隆、核酸電泳、瓊脂糖凝膠電泳、測序DNA、RNA 提取、轉化外源DNA、體外轉錄、逆轉錄、cDNA文庫構建、原位雜交、酵母雙雜交、差減雜交、扣除雜交，藍白斑篩選、抗生素篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

真菌菌種，真菌菌種分為標準株與實驗株，抽取念珠菌、煙曲霉菌，克柔念珠菌、新生銀球菌近視分離實驗。細菌菌株：大腸埃希氏菌、銅綠假單細胞菌、黃金色葡萄球菌，實驗株，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌、腸球菌，通過實驗室對其標本進行分離鑒定。

培養基：SDA

緩沖液：抽取DNA緩沖液、電泳緩沖液、10%SDS、電泳點樣緩沖液。

分子量標記： DNA/EcoRI+Hind（0.5pg/pl），由上海華美生物工程有限公司提供。

酶及PCR反應體系

Taq DNA聚合酶、PCR反應緩沖液等。

1.2 實驗方法

將在人體內抽取到的真菌基因進行DNA制備：實驗菌種接種與SDA器皿中，在28℃的溫度下培養一周，用牙簽刮去菌絲體，入到離心管中，進行稱重，DNA采用酚氯仿進行純化，將DNA與溴酚藍緩沖液進行混合，點樣與0.8%瓊脂凝膠。

菌株基因組的DNA引物PCR：模板的DNA準備，提取DNA在分光光度儀的1000分廣度上測定波長為260納米的OD值，以1XTE進行稀釋。

引物準備：對引物進行準備，1 0D+379ulddh2o稀釋至濃度為10uM。

PCR起始反應：起始變性，溫度在94℃以上，5 min，變形溫度為94℃，1 min，退火47℃，1 min。延伸72℃，1 min，38個循環，72℃延伸5 min。

PCR加樣順序，在0.5 mg的量管中，需要加入ddH2o，在加入PCR buffer、dNTP、引物、模板和聚合酶。在同一引物中，不同模板的PCR反應是不同的，可以按照上述的加樣順序，按照一定比例加入到母管中，分裝入到不同的模板中。對PCR產物進行保存，產物可以暫存于4℃，若是需要存儲，在要冷凍與零下20℃。

電泳：配制1.2%的瓊脂糖凝膠，凝膠中繳入EB溶液，濃度達到要求。點樣：取一定量的PCR產物，與溴酚藍緩沖液緩和，加入點樣孔中，在紫外透射下照相。

2 結果

2.1 DNA抽取結果

在檢驗的過程中，絲狀真菌DNA片頓大小都是在21KB以上，電泳凝膠上的溴酚藍沒有出現RNA模糊亮團的情況。用DNA試劑盒法，以便能夠提取酵母菌中的DNA，觀察可發現大小均在21KB以上，呈帶狀，片段保存比較完整。

2.2 引物PCR的分析

在電泳凝膠上，可以觀察到衛星引物和隨機引物，并且能夠很好的觀察到一些常見的皮膚菌類，致病念珠菌，可以和常見的酵母菌區分開來。在實驗中不難發現，引物PCR的方法很穩定，對于區別皮膚菌類和非皮膚菌類都有很好的效果，現實的條帶差別比較明顯和直觀。

3 討論

病原真菌感染是皮膚常見的多發病和常見癥。其中發病的位置都會在手癬、體癬、手足癬等一些淺表念珠菌病。真菌感染主要以皮膚癬菌和非皮膚癬菌為主。病原真菌的發病范圍比較廣，復發率也比較高。根據調查，在2011年和2012年中華醫學會的皮膚病調查顯示，在皮膚科門診的患者中，足癬發病率高達45%和42%，甲真菌病的發病率達到15%，就個人來講，病原真菌在很大程度上影響患者的生活質量。目前對于病原真菌的治療有很多治療方法，有很多新的廣譜藥物，都有不同抗菌譜。有些皮膚使用新的藥物來控制癬菌，但有的藥物控制的副作用比較大，會出現不同的抑菌濃度。

最近幾年，人類真菌感染的發生率也在不斷上升，而這些問題也會引起很多醫學研究者的注意。傳統對真菌分子生物學檢測的方法是形狀學檢測和分離培養等步驟，傳統的方法費用較高，浪費大量的時間，敏感度低，而且特異性也比較低。PCR是一種真菌分子生物學檢測技術，主要用于方法特定某個部分的DNA片段。PCR方法的問世，也使得分子生物學檢測技術得到了迅速的發展。PCR的體外酶促方法，也可以擴增位于兩端的序列DNA。而對于PCR的改進技術，需要針對敏感性和特異性來操作。PCR的方法已經滲透到各個領域中，并且應用于真菌的治療中。根據真菌的序列設計通用引物，使用PCR的方法擴增來判定感染真菌的種類和特異性的引物。有的會選用靶基因，并且亞基序列比較保守，應用于真菌通用引物比較方便，比較成熟的引物有NS1、NS3等等。有的研究學者表明，采用熒光標記引物擴增特異性ITS，結果能夠證明，獲得血液和組織的致病性在真菌種水平上的區分效果。也有研究者用多重PCR測定法來進行鑒定口腔念珠菌，采用CA4、ITS1等等進行檢測。經過檢測，所有的菌種檢測都要比培養法準確得多，也就說多重PCR也是一種快速的檢測方法。

對于傳統的分子生物技術檢測的方法比較復雜，觀察容易出現誤差、分型粗糙、因變異所導致出現重復性差的缺點，所以對分子水平進行分類檢測也是必須的。病原真菌感染在傳統的分類中，主要依靠體內的培養形態和生理生化特征和免疫學等方法。這種方法也比較繁瑣，并且主觀性強、周期長、重復性，并且也受到環境因素的影響，在分類能力和穩定性上受到一定的限制。按照一定的標準對DNA的雜交檢測測定染色體序列。從基因的分型中顯示其優點和特點。而最近發展起來的，脈沖電場凝膠電泳的技術，已經被充分應用在生物基因的分析和鑒定。

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