TACE激酶在豬排卵過程中的作用機制

王亞磊，茆達干

（南京農業大學動物科技學院，南京 210095）

腦垂體分泌的促黃體素（LH）可以刺激排卵前卵泡，誘導排卵過程：包括卵泡壁的破裂，顆粒細胞黃體化，卵丘擴展以及卵母細胞減數分裂的成熟。LH 受體主要在顆粒細胞中表達，顆粒細胞黃體化水平過高時受體即降解，因此，可能需要其它潛在因子與顆粒細胞、卵丘細胞或卵母細胞互作誘導排卵過程的進行。Conti 等通過研究PMSG 與hCG 刺激的小鼠卵巢顆粒細胞mRNA表達圖譜，發現hCG 作用后的EGF 樣因子、雙調蛋白(AREG)、表皮調節素（EREG）和β-動物纖維素(BTC)表達量明顯升高，應用這些因子體外培養能加強卵丘細胞的擴展以及小鼠卵母細胞減數分裂的成熟。EGF 樣因子作用于EGFR，激活顆粒細胞和卵丘細胞中的Ras-MAPK1/3 通路，而含該通路下游基因Erk1/2 突變的干擾卵母細胞的成熟、卵丘的擴展和顆粒細胞黃體化則會受到抑制，因此，EGF 樣因子可能是顆粒細胞自分泌的關鍵調節因素之一，使LH 依賴的顆粒細胞信號轉向卵丘細胞和卵母細胞。EGF 樣因子是含有一個信號序列、一個跨膜區域和至少一個EGF 區域的跨膜蛋白。金屬蛋白酶作用于EGF 區域，使EGF 樣因子作為配基激活同源受體。腫瘤壞死因子α-轉運酶（TACE），又稱為ADAM17，是ADAM 蛋白酶家族成員之一。Sahin等證明TACE 是小鼠胚胎細胞AREG和EREG 主要蛋白脫落物。TACE 在心臟、大腦、肺、肝臟、肌肉、腎臟和睪丸中均有表達。EGF 樣因子在排卵過程中的表達機制已被報道，但這些因子如何被特異性激活為配基，尤其是關于TACE/ADAM17的表達和功能還未見報道。本文介紹了TACE/ADAM17的表達和激活機制以及在豬卵母細胞成熟過程中顆粒細胞和卵丘細胞內的生理功能。

1 TACE/ADAM17在豬顆粒細胞和卵丘細胞中的表 達

TACE/ADAM17屬于去整合素和金屬蛋白酶（A Disintegrin And Metalloproteinase,ADAM）蛋白家族成員，該家族包含30 多種蛋白質，其中約50%主要在睪丸中表達，調控精子發生過程，其他成員主要在神經發生、肌生成、骨生成和免疫調節中發揮作用。與其他ADAM 蛋白家族不同，TACE/ADAM17mRNA 主要在免疫組織中表達，在癌細胞中高量表達，參與激活EGFR-MAPK3 通路從而引起癌細胞增殖和遷移。排卵過程中EGF 樣因子的表達可以短暫顯著地激活顆粒細胞和卵丘細胞中EGFR-MAPK3/1 通路。因此可推測在排卵過程中TACE/ADAM17可能作為EGF 樣因子的脫落酶在顆粒細胞和卵丘細胞中表達。

應用eCG/hCG 預處理的豬有腔卵泡、排卵前卵泡和接近排卵的卵泡中顆粒細胞和卵丘細胞TACE/ADAM17mRNA 表達出現短暫變化。進一步研究結果顯示，單獨應用eCG 來誘導卵泡發育到排卵前階段，顆粒細胞和卵丘細胞中TACE/ADAM17mRNA 的表達水平并沒有增加，然而再由hCG 刺激時mRNA 表達顯著增加。

為了闡明TACE/ADAM17如何在排卵過程中的表達，應用體外顆粒細胞和卵丘卵母細胞復合體（COCs）培養實驗，發現FSH 和/或LH 處理可以增加這2 種細胞TACE/ADAM17mRNA 的表達水平，從而導致Areg 和Ereg mRNA 的表達量增加。Western Blotting 結果表明COCs 的卵丘細胞內FSH 和LH 誘導的蛋白表達量亦有增加。研究還發現，TACE/ADAM17的表達量可被PKA、p38MAPK 或MAPK3/1 通路的抑制劑抑制。TACE鄰近的啟動子包括大量的AP2 和Sp1轉錄因子結合位點，并且包含一個GC框 和 一 個CCAAT 框（MAPK3/1 的靶位點）。C/EBPα 和C/EBPβ 可以直接結合到啟動子區域的CCAAT 框，但是它們亦可被PKA 和p38MAPK 通路激活。小鼠的顆粒細胞LH 刺激可迅速激活PKA 和p38MAPK 通路，然后EGF 樣因子的表達誘導MAPK3/1的磷酸化。因此，PKA 和p38MAPK激活的TACE/ADAM17表達可以釋放EGF 樣因子的EGF 區域，進而增加MAPK3/1 的磷酸化水平。MAPK3/1-C/EBP 通路可以進一步增加TACE/ADAM17的表達水平從而維持信號通路的激活狀態。

2 TACE/ADAM17在豬顆粒細胞和卵丘細胞中的功能

已經報道的TACE/ADAM17在許多組織和細胞類型中的可能基質包括轉移生長因子α（TGFα），肝素結合表皮生長因子（HB-EGF），Notch，Areg 和Ereg。 小 鼠 卵 巢TGFα 和HB-EGF 低量表達，并且在卵泡發育和排卵過程中表達量沒有變化，表明這些因子不是TACE/ADAM17的潛在靶蛋白。Johnson 等報道了生長卵泡中作用于PMSG 的Notch mRNA，但Notch 在卵母細胞成熟過程中的作用未被證實。

在排卵過程中Areg 和Ereg 在顆粒細胞和卵丘細胞中表達，它們隨著TACE/ADAM17mRNA 的表達水平增加而誘導，表明Areg 和Ereg 可能是接近排卵卵泡中TACE/ADAM17的生理基質。應用促性腺激素培養豬COCs 40 h 能 增 強TACE/ADAM17酶的活性。EGF 或促性腺激素誘導COCs 的卵丘細胞中MAPK3/1 的磷酸化。TACE/ADAM17的選擇抑制劑TAPI-2 降 低FSH 和LH 誘 導 的 豬COCs 或顆粒細胞MAPK3/1 的磷酸化水平。然而，在EGF 樣因子誘導培養的COCs 或顆粒細胞中這些抑制效應就不存在。此外，在大鼠的顆粒細胞，LH 誘導的MAPK3/1 的磷酸化可被TACE/ADAM17干 擾RNA 的 轉 染 所抑制。因此，在顆粒細胞和卵丘細胞中TACE/ADAM17的表達可能促進EGF樣因子EGF 區域的釋放，從而激活在排卵過程中的顆粒細胞和卵丘細胞中EGFR-MAPK3/1 通路。

3 豬COCs的卵丘細胞中EGF樣因子、TACE/ADAM17 和PGE2的正反饋調節

排卵前卵泡的卵泡液中含有大量的前列腺素E2（PGE2）。敲除Ptgs2（編碼環氧化酶2，COX-2）或Pger2（編碼PGE2 受體2，PGER2）的小鼠表現為卵母細胞排出數量減少，受精能力降低。先前的研究表明Ptgs2 敲除的小鼠在施加hCG 過程中EGF 樣因子的表達量減少，而EGF 樣因子又會使Ptgs2的表達量增加，表明在排卵過程中EGF樣因子與PGE2 之間存在正反饋系統。

對豬的COCs 進行體外培養實驗， 由FSH 誘 導Ptgs2 和Ptger2 的表達進而引起Areg、Ereg 和TACE/ADAM17的表達。利用PTGS2 的抑制劑NS398 培養COCs 10 h，顯著降低卵丘細胞中Areg，Ereg 和TACE/ADAM17的表達量，但是培養5 h 的細胞沒有變化。豬的COCs 體外培養成熟過程中，cAMP 水平5 h 內顯著增高，一直持續到40 h。然而，單獨用FSH培養的COCs 的卵丘細胞中，編碼FSH 受體的Fshr 基因表達水平顯著性降低，這表明增加卵丘細胞中cAMP 水平的其他刺激物是由卵丘細胞分泌的。通過NS398 培養5 h 時cAMP 水平沒有發生變化，而培養10 h 就會明顯降低，且顯著抑制MAPK3/1 通路。在豬和小鼠中，單獨添加PGE2 會誘導卵丘擴展，卵母細胞減數分裂的成熟，表明PGE2 是作用于卵丘細胞維持cAMP水平的第二因子。結果表明EGF 樣因子和TACE/ADAM17的最初表達是促性腺激素依賴性的，然而EGF 樣因子和TACE/ADAM17的持續表達依賴于PGE2-PGER2 通路。

4 豬COCs的卵丘細胞中PGR通路調控TACE/ADAM17的末端表達

敲除Nr3c3 基因（編碼孕酮受體，PGR）的小鼠不能排卵，然而這些小鼠卵巢的組織學分析表明注射hCG 后卵丘會正常擴展。另一方面，豬的COCs體外培養成熟過程中PGR 的藥理抑制物或孕酮產物會顯著抑制卵丘的擴展和卵母細胞的成熟。另外，單個COC 培養時，卵母細胞減數分裂的起始階段相對于20 個COCs 一起培養時明顯會被推遲。介質中孕酮的含量隨每孔COCs數的增加而增加，表明孕酮-PGR 通路至少會影響體外培養的豬COCs 中卵丘的擴展和卵母細胞的成熟。

為了確定孕酮-PGR 通路的作用， 進 一 步 對EGFR-MAPK3/1 通路進行了研究發現，添加PGR 的抗性劑RU486 不影響FSH 誘導的Areg和Ereg 在任何培養階段的表達，也不會影響培養20 h 的COCs 的卵丘細胞 中TACE/ADAM17mRNA 的 表達，但會明顯抑制培養30 h 和40 h 的TACE/ADAM17mRNA 的表達，培養40 h 時MAPK3/1 的磷酸化水平以及靶基因（Fas2 和Tnfaip6）的表達被顯著性抑制。此外，卵丘的擴展和達到減數分裂MII 階段的卵母細胞百分率也會被RU486 抑制。這些結果表明，孕酮-PGR 通路在卵丘擴展過程后期調節TACE/ADAM17的表達，但不影響EGF 樣因子水平，這對豬的卵丘擴展和卵母細胞減數分裂成熟過程中EGF 樣因子的末端分泌是很重要的。然而，由于TACE/ADAM17基因的啟動子區域并不包含孕酮應答元素（PRE），因此，孕酮-PGR 通路怎樣調節末端的TACE/ADAM17基因表達需要進一步研究。

5 結論

EGF 樣因子是促進卵母細胞成熟和排卵的重要因子。通過TACE/ADAM17釋放EGF 樣因子的EGF 區域導致EGFR-MAPK3/1 通路的激活，從而誘導豬的COCs 中卵丘的擴展和卵母細胞的成熟。

略)