哺乳動物細胞核移植研究進展

王愛萍

（四川衛(wèi)生康復職業(yè)學院 基礎教研室，四川 自貢 643000）

哺乳動物細胞核移植是指將發(fā)育不同時期胚胎細胞或成年動物體細胞的細胞核，經(jīng)顯微操作，移植到成熟的去核卵母細胞中，組成重構胚并使之發(fā)育成新動物個體的技術。細胞核移植是動物克隆的主要途徑，所以又稱之為克隆技術。1997年體細胞克隆綿羊Dolly的誕生（Wilmut et al,1997）,是細胞核移植技術的一個重要的里程碑。它向全世界證明了高度分化的體細胞具有遺傳的全能性和發(fā)育的可逆性。在科學領域引發(fā)了克隆動物研究的高潮。

1 核移植技術的國內外研究現(xiàn)狀

細胞核移植技術是德國發(fā)育生物學家Spermann[1]于1938年為解決核質相互關系問題提出把分化的細胞導入去核的卵母細胞中并觀察其胚胎發(fā)育情況的研究，同年他還提出將任何時期的細胞核注入去核卵母細胞內然后通過觀察其發(fā)育能力就可以確定該時期細胞核的發(fā)育潛能的設想。但由于當時核移植技術條件的限制，用分化的細胞未能獲得成功。直到20世紀50年代，才有兩棲類美洲豹蛙和非洲瓜蟾克隆的報道（Briggs和King,1952）。隨后Gurdon等用蟾蜍、蝌蚪的腸上皮細胞和體外短期培養(yǎng)的完全分化的體細胞進行核移植分別獲得成體蟾蜍和蝌蚪，證實兩棲類已分化細胞的基因組具有結構上的完整性和功能上的全能性。此后，人們轉向哺乳動物細胞核移植研究。

哺乳動物核移植研究的最初成果在1981年取得，Illmensee和Hoppe[2]用鼠內細胞團細胞直接注入去核的合子后，培育出發(fā)育正常的3只小鼠。但這一試驗未能被重復出來；1983年，McGrath和Solth首次利用顯微操作技術和細胞融合技術，以單細胞期的小鼠胚胎作為供核細胞進行核移植，得到了核移植后代，并建立了重復性很高的核移植操作程序[3]；1994年，Collas和Barrnes將供核細胞通過卵母細胞內直接注射的方法構建了核移植重構胚胎，并得到了犢牛[4]；這一時期許多研究者對胚胎干細胞和成年動物體細胞的核移植試驗也做了大膽嘗試，但進展不大。1997年，在細胞核移植研究歷史上發(fā)生了一件具有轟動效應的事件，英國羅斯林研究所的研究人員首次利用成年母綿羊的乳房上皮細胞，通過細胞核移植技術得到了體細胞克隆羊——“Dolly”[5]，“Dolly”的出生以事實向人們證明，完全分化的體細胞不僅可以被逆轉，而且完全可以發(fā)育成一個新的個體。從此以后，全世界掀起了體細胞克隆的熱潮。1998年Wakayama等利用小鼠卵丘細胞進行體細胞核移植研究獲得成功[6]；1999年Wells等用牛顆粒細胞進行核移植也獲得了成功[7]。至2002年，Keefer等[9]人將91枚重構胚移植到8只受體山羊體內，50%受孕，生出7只小山羊，核移植效率明顯比以前提高。迄今為止，全世界已有乳腺細胞[5]、卵丘細胞和輸卵管上皮細胞[8]、顆粒細胞[7]、肌肉細胞[10]、皮膚細胞[11]、睪丸支持細胞[12]、胎兒成纖維細胞[9]和耳皮膚成纖維細胞[13]等9種體細胞克隆后代成功誕生。

我國的細胞核移植技術研究開始于20世紀60年代。1963年，著名試驗胚胎學家童第周利用胚胎細胞克隆技術進行魚類囊胚細胞核移植研究，在70年代獲得屬間和種間核移植魚。上個世紀九十年代起，國內學者開始進行哺乳動物克隆研究。1991年，張涌等[14]利用4～32細胞的胚胎克隆了5只山羊。2000年，楊向中領導的科研小組，用一頭17歲高齡奶牛耳皮膚細胞進行體細胞核移植研究，獲得了6頭體細胞克隆牛[15]。標志著中國已完全掌握了世界一流的體細胞克隆牛技術，從1997年到現(xiàn)在短短幾年的時間里，在體細胞核移植領域里，人們相繼在牛、山羊、豬、貓和兔等多種動物上取得了成功。

2 目前核移植技術中存在的問題

2.1 體細胞克隆成功率低

同體外授精相比，效率低是目前核移植技術應用發(fā)展中普遍存在的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)在:囊胚發(fā)育率不穩(wěn)定，移植后受胎率低，出現(xiàn)畸胎、死胎、流產(chǎn)以及出生后早亡率高，造成效率低。但不同的學者對此產(chǎn)生的意見卻不一，有人認為是培養(yǎng)條件未達到最佳化，也有人認為是細胞的問題，現(xiàn)有資料表明，即使應用體內培養(yǎng)的方法成活率也不過10%,看來試圖通過改進培養(yǎng)體系來提高核移植效率還無從著手。因此，要更深入地研究核質間的互作機理，以便使核移植技術得到進一步改善。

2.2 供體核與受體胞質細胞周期同步的問題

第一次體細胞核移植獲得成功的重要因素之一就是對細胞周期同步化的認識，而且研究人員也首次認識到應用G0期細胞的必要性。目前體細胞核移植中常用的方法就是將處理后的供體細胞核移入到去核的MII期卵母細胞中，迄今為止，幾例成功的豬體細胞核移植研究中，都采用了去核的成熟MII期卵母細胞作為核受體。大多數(shù)研究者認為用成熟的去核MII期卵母細胞作為核受體，有利于啟動已分化的供體核在重構胚中的再程序化，保證一定的核移植成功率。當用去核的MII期卵母細胞作為受體細胞時，必須使供體細胞與受體細胞的細胞周期同步化，這樣有助于重組胚胎的發(fā)育。 在卵母細胞激活后，MPF活性下降、染色質去凝集，在核膜重建的過程中 DNA復制，染色體加倍，因而核移植時供體細胞周期的選擇對于第一次細胞分裂末期，染色體二倍體的保持是很重要的。

2.3 體細胞基因突變和其他遺傳問題

研究證明，基因突變與DNA復制次數(shù)有著密切的關系，分裂次數(shù)越多的體細胞，發(fā)生突變的可能性越大。對于核移植材料來源方面，這是不可避免的問題。如果把動物的基因組弄清楚，并能對體細胞的突變基因加以修復的話，核移植的效率一定能夠得到大大的提高。

3 哺乳動物核移植技術的應用前景

3.1 擴大優(yōu)良育種群和拯救瀕危動物

采用核移植技術可加速育種的過程，在短時間內有效地擴大種群的數(shù)量，保持種群的性狀，避免了自然交配所帶來的優(yōu)良性狀的分離和減弱。將核移植與基因打靶相結合，可以對物種的基因進行定點修飾，產(chǎn)生具有優(yōu)良性狀的新品種。用家畜的體細胞進行基因打靶可將我們感興趣的目的基因插入到特定的位置，把篩選出的陽性克隆作為核供體進行核移植，這樣便可獲得組織特異性表達的轉基因動物。

3.2 體細胞克隆技術在醫(yī)藥生產(chǎn)方面的價值

將體細胞克隆技術與生物反應器的生產(chǎn)制作技術結合可以對體細胞進行轉基因或基因組修飾后，制作生產(chǎn)生物反應器 利用動物的乳腺、膀胱等器官，生產(chǎn)治療人類疾病、保健所需的蛋白。許多全球知名的生物技術企業(yè)尤其看重體細胞克隆技術在這些方面的應用價值，紛紛投資科研機構開展研究，實際上第一個體細胞克隆動物綿羊Dolly的誕生就是這種動機的直接產(chǎn)物。

3.3 在臨床方面的作用

通過深入研究細胞核質的相互作用 控制胚胎細胞的分化方向，有望獲得適合向人體移植的具有遺傳改變的動物器官。通過細胞核移植技術可以避免不必要的免疫排斥作用。目前，人們已經(jīng)利用體細胞克隆技術獲得了小鼠-小鼠、人-兔、人-人 ES細胞系，并已經(jīng)在小鼠模式上開展了如帕金森氏癥等神經(jīng)退行性疾病的治療嘗試。

4 結語

盡管目前來看，哺乳動物核移植仍然面臨很多問題，哺乳動物核移植技術自身仍在不斷完善中但相信隨著分子遺傳學、細胞生物學和發(fā)育生物學等相關基礎學科的進一步發(fā)展，哺乳動物核移植將在未來的生物學及人體器官移植等方面扮演著重要的角色。

［1］Spemann H.Embryonic development induction[M].New York:Hafner Publishing Co.,1938:210－211.

［2］Illmensee K,Hoppe PC.Nucler transplantation in Mus musculus developmental of nuclei from preimplantation embryos[J].Cell.，1981,23（1）:9－18.

［3］McGrath J,et al.Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery cell fusion[J].Science，1983,220:1300－1302.

［4］Collas P,et al.Nuclear Transplantation by microinjection of inner cell mass and granulose cell nuclei[J].Mol Reprod Dev，1994,38:264－267.

［5］Wilmut I,Schnieke AE,McWhir J,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature，1997,385:810－813.

［6］Wakayama T,Perry ACF,Zuccotti M,Johnson KR,Yanagimachi R.Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.Nature，1998,394:369－374.

［7］Wells DN,Misica PM,Tervit HR.production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulose cells[J].Biol Reprod.1999,60:996－1005.

［8］Kato Y,Tani T,Sotomaru Y,Kurokawa K,Kato J,Doguchi H,Tsunoda Y.Eight calves cloned from somatic cells of a singer adult[J].Science，1998,282:2095－2098.

［9］Keefer CL,Keyston R,Lazaris A,Bhatia B,et al.Production of cloned goats after nuclear transfer using adult somatic cells[J].Biol Reprod，2002,66（1）:199－203.

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［11］Kato Y,Tani T,Tsunoda Y.Cloning calves from various somatic cell types of male and female adult newborn and fetal cows[J].Repord Fertil，2000,120(2):231－237.

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［13］Park KW,Lai L,Cheong HT.Mosaic gene expression in nuclear transferderived embryos and the production of cloned transgenic pigs from ear-derived fibroblasts[J].Biol Reprod，2002,66（4）:1001－1005.

［14］張涌，王建辰，錢菊汾，等.山羊卵核移植的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，1991，24（5）:1－6.

［15］桑潤滋，主編.動物繁殖生物技術[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.