高效液相色譜法測(cè)定帕米膦酸二鈉含量

呂治紅，霍建富

（山西康寶生物制品股份有限公司，山西 長(zhǎng)治046011）

帕米膦酸二鈉作為第二代雙膦酸鹽類(lèi)藥物，在抑制破骨細(xì)胞的活性方面有明顯效果，作為治療多發(fā)性骨髓瘤溶骨性病變的有效藥物已被廣泛應(yīng)用于臨床［1］，并具有療效好、安全性高的特點(diǎn)，尤其是治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者時(shí)，止痛效果好、不良反應(yīng)輕，病人樂(lè)于接受［2］。

作者在此采用高效液相色譜法測(cè)定帕米膦酸二鈉的含量，具有準(zhǔn)確、快捷的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 試藥與儀器

樣品：帕米膦酸二鈉原料藥（批號(hào)120201、120202、120203），山西康寶生物制品股份有限公司。

對(duì)照品：由批號(hào)120201帕米膦酸二鈉精制而得。

甲醇、氯苯、N，N－二甲基甲酰胺（DMF），分析純。

0．4%乙二胺四乙酸二鈉的氫氧化鈉溶液：取乙二胺四乙酸二鈉0．4g與氫氧化鈉0．034g，加水溶解并稀釋至100mL。

硼酸鹽緩沖溶液（pH值10．0）：取無(wú)水四硼酸二鈉6．04g與氫氧化鈉1．68g，加水溶解并稀釋至1000 mL。

LC6A型液相色譜儀，Echrom98色譜工作站，Zorbax SB－C18色譜柱（4．6mm×250mm，5μm），RF－535型熒光檢測(cè)器。

1．2 供試品溶液和對(duì)照品溶液的配制

避光操作，取樣品適量（約相當(dāng)于帕米膦酸二鈉20mg），精密稱(chēng)定，置100mL量瓶中，加硼酸鹽緩沖溶液（pH值10．0）40mL，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10mL，置100mL量瓶中，精密加入0．1%熒光胺的乙腈溶液10mL，邊加邊振搖，在20～40s內(nèi)加完，放置15min，用硼酸鹽緩沖溶液（pH值10．0）稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

另取對(duì)照品約20mg，同法操作，制備對(duì)照品溶液。

1．3 HPLC方法［3］

1．3．1 色譜條件

色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動(dòng)相為乙腈－0．4%乙二胺四乙酸二鈉的氫氧化鈉溶液（15∶85），熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)為395nm，發(fā)射波長(zhǎng)為480 nm，流速為1．0mL·min－1，進(jìn)樣量為10μL。

1．3．2 系統(tǒng)適用性測(cè)試

取對(duì)照品溶液用微孔濾膜（0．45μm）過(guò)濾，取續(xù)濾液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖1計(jì)算得到帕米膦酸二鈉理論塔板數(shù)為5779．8，分離度為32．3。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件的選擇

2．1．1 波長(zhǎng)的選擇

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖Fig．1 The HPLC chromatogram for determining of system applicability

選擇熒光胺特征激發(fā)波長(zhǎng)395nm和發(fā)射波長(zhǎng)480nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，能有效地對(duì)帕米膦酸二鈉進(jìn)行檢測(cè)。

2．1．2 流動(dòng)相的選擇

以帕米膦酸二鈉原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) WS1－（X－294）－2004Z［4］含量測(cè)定的流動(dòng)相——乙腈－0．4%乙二胺乙醋酸二鈉的氫氧化鈉溶液（14∶86）為基礎(chǔ)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行篩選。最終確定流動(dòng)相為乙腈－0．4%乙二胺四乙酸二鈉的氫氧化鈉溶液（15∶85），采用上述流動(dòng)相時(shí)，帕米膦酸二鈉分離度及柱效（理論塔板數(shù)為5779．8，分離度為32．3）均很好。

2．2 定量限及檢測(cè)限

在1．3．1色譜條件下，按儀器噪音的10倍響應(yīng)值測(cè)定最小定量限；按儀器噪音的3倍響應(yīng)值測(cè)定最小檢測(cè)限。取帕米膦酸二鈉溶液逐級(jí)稀釋進(jìn)樣，確定帕米膦酸二鈉的定量限及檢測(cè)限濃度分別為0．5μg·mL－1和0．25μg·mL－1，即帕米膦酸二鈉定量限及檢測(cè)限分別為5ng、2．5ng。定量限和檢測(cè)限檢測(cè)的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 定量限（a）和檢測(cè)限（b）檢測(cè)的色譜圖Fig．2 The HPLC chromatograms for determining of quantification limit（a）and detection limit（b）

2．3 樣品破壞實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào)120202）5份，其中4份依次加入1mol·L－1鹽酸10mL放置5d、加入1mol·L－1NaOH溶液10mL放置5d、置沸水中加熱2h、加入3%的雙氧水溶液10mL放置5d，第5份置于4500Lx光照條件下放置5d。將各樣品溶液配制成終濃度為0．02mg·mL－1的溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，分別精密量取10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿破壞樣品的色譜圖見(jiàn)圖3，各樣品破壞實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 強(qiáng)酸（a）、強(qiáng)堿（b）破壞樣品的色譜圖Fig．3 The HPLC chromatograms of the samples destructed by strong acid（a）and strong alkali（b）

表1樣品破壞實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 The results of sample destruction experiment

由表1可知，樣品對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化均不穩(wěn)定，對(duì)強(qiáng)熱、強(qiáng)光較穩(wěn)定，經(jīng)不同條件破壞后，樣品與降解產(chǎn)物分離度均大于1．5（理論塔板數(shù)大于3000），各降解產(chǎn)物不影響主峰測(cè)定，表明建立的高效液相色譜方法適合作為含量測(cè)定的方法。

2．4 穩(wěn)定性

分別于0h、2h、4h、6h、8h精密量取10μL供試品溶液（批號(hào)120202）注入色譜儀中，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．2 The results of the stability experiment

由表2可知，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2．5%，說(shuō)明供試品溶液在室溫下至少穩(wěn)定8h，可滿(mǎn)足含量測(cè)定的需要。

2．5 精密度

精密量取10μL供試品溶液（批號(hào)120202），注入色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．3 The results of the precision experiment

由表3可知，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1．0%，說(shuō)明方法的精密度良好。

2．6 線性關(guān)系

避光操作，取對(duì)照品適量（約相當(dāng)于帕米膦酸二鈉20mg），精密稱(chēng)定，置100mL量瓶中，加硼酸鹽緩沖溶液（pH值10．0）40mL，加水稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取 0．1mL、0．4mL、0．6mL、0．8mL、1．0mL，置10mL量瓶中，精密加入0．1%熒光胺的乙腈溶液1mL，邊加邊振搖，在20～40s內(nèi)加完，放置15min，用硼酸鹽緩沖溶液（pH值10．0）稀釋至刻度，搖勻，得到帕米膦酸二鈉濃度為2．03μg·mL－1、8．12μg·mL－1、12．18μg·mL－1、16．24μg·mL－1、20．3μg·mL－1的溶液，分別精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、帕米膦酸二鈉濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，見(jiàn)圖4。

圖4 帕米膦酸二鈉工作曲線Fig．4 The working curve of pamidronate disodium

由圖4可知，擬合線性回歸方程為y＝193231x－66701（R2＝0．9994），說(shuō)明在2．03～20．3μg·mL－1的范圍內(nèi)帕米膦酸二鈉濃度與峰面積的線性關(guān)系較好。

2．7 重復(fù)性

精密量取10μL供試品溶液（批號(hào)120202）5份，注入色譜儀中，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果／%Tab．4The results of the repeatibility experiment／%

由表5可知，帕米膦酸二鈉含量的RSD小于0．5%，表明方法重復(fù)性良好。

2．8 樣品測(cè)定

取3批帕米膦酸二鈉樣品（批號(hào)120201、120202、120203），按建立的HPLC測(cè)試其中帕米膦酸二鈉的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab．5 The results of sample determination

由表5可知，3批樣品的帕米膦酸二鈉含量≥99．6%，符合要求。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法測(cè)定帕米膦酸二鈉的含量，流動(dòng)相為乙腈－0．4%乙二胺四乙酸二鈉的氫氧化鈉溶液（15∶85），熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)為395nm，發(fā)射波長(zhǎng)為480nm，流速為1．0mL·min－1，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果表明，帕米膦酸二鈉定量限及檢測(cè)限分別為5ng、2．5ng；精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于1．0%；在2．03～20．3μg·mL－1范圍內(nèi)帕米膦酸二鈉濃度與峰面積線性關(guān)系良好。此方法重復(fù)性高、穩(wěn)定性好，可準(zhǔn)確、快捷地測(cè)定帕米膦酸二鈉的含量。

［1］屈統(tǒng)友，葉佳佳．帕米膦酸二鈉的治療應(yīng)用與不良反應(yīng)［J］．海峽藥學(xué)，2008，20（9）：144－145．

［2］楊立，成志．放療和帕米膦酸二鈉治療骨轉(zhuǎn)移癌疼痛的療效觀察［J］．腫瘤防治研究，2004，31（5）：307－308．

［3］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（二部）［M］．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010．

［4］WS1－（X－294）－2004Z，帕米膦酸二鈉［S］．