X－5大孔吸附樹脂分離純化黑柴胡黃酮及抗氧化性研究

李 帥，胡繼榮，劉軍軍，何 杰，馬興元，吳冬青

（河西學院化學化工學院 甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖734000）

黑柴胡（Bupleurum smithii Wolff），別稱小五臺柴胡、小五呂柴胡、楊家坪柴胡，是傘形科柴胡屬多年生草本植物，主要分布于河北、山西、陜西、河南、青海、甘肅等地，味苦、性微寒，具有解熱、抗炎等功效［1］。大孔吸附樹脂具有吸附快、容量大、洗脫率高、可再生等優(yōu)點［2］，廣泛應(yīng)用于分離黃酮、多糖、生物堿等化合物［3－5］。作者利用X－5大孔吸附樹脂對黑柴胡黃酮粗提液進行分離純化，并對純化前后黑柴胡黃酮清除·DPPH、ABTS＋能力及還原力進行比較，旨在為分離純化黑柴胡黃酮提供參考。

1 實驗

1．1 材料、試劑與儀器

黑柴胡，2010年采自甘肅隴西。

X－5大孔吸附樹脂，南開大學化工廠；蘆丁，生化試劑，醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；·DPPH，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS，東京化成工業(yè)株式會社；抗壞血酸（Vc）、丁基羥基茴香醚（BHA）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、丙酮、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等均為分析純。

WFJ2100型可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；RE－2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHA－B型恒溫振蕩器，國華電器有限公司。

1．2 方法

1．2．1 黑柴胡黃酮提取流程

干燥黑柴胡→粉碎→過50目篩→75%乙醇回流1h［料液比1∶30（g∶mL）］→提取2次→濾液合并→濃縮至無醇味→定容至100mL→黑柴胡黃酮粗提液冷藏備用。

1．2．2 黑柴胡黃酮的分離純化

1．2．2．1 樹脂的預處理［6］

X－5大孔吸附樹脂10g→丙酮回流3h（水浴溫度50℃）→過濾→95%乙醇浸泡24h→過濾→蒸餾水洗至無醇味→過濾→5%HCl浸泡3h→過濾→蒸餾水洗至中性→5%NaOH浸泡3h→過濾→蒸餾水洗至中性→抽干→冷藏備用。

1．2．2．2 靜態(tài)吸附實驗［6，7］

準確稱取已處理好的樹脂1．000g置于100mL具塞錐形瓶中，加入pH值為2的0．09410mg·mL－1黃酮粗提液25．00mL，振蕩（30 ℃，轉(zhuǎn)速150r·min－1）吸附12h，準確吸取上清液1．00mL測定黃酮質(zhì)量濃度，按式（1）計算吸附率：

式中：c為吸附前溶液的黃酮質(zhì)量濃度；c′為吸附后溶液的黃酮質(zhì)量濃度。

按上述方法，首先考察黃酮粗提液pH值對吸附效果的影響，選擇適宜的pH值；然后在吸附中每隔1h吸取上清液測定黃酮質(zhì)量濃度，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線；最后改變粗提液中黃酮的質(zhì)量濃度進行實驗，繪制吸附等溫曲線。

1．2．2．3 解吸實驗［6，7］

將最佳靜態(tài)吸附條件下吸附飽和樹脂過濾，用蒸餾水沖洗后置于100mL具塞錐形瓶中，加入不同體積分數(shù)的乙醇50．00mL，振蕩（60℃，轉(zhuǎn)速150r·min－1）解吸12h，準確吸取解吸液1．00mL測定黃酮質(zhì)量濃度，按式（2）計算解吸率并繪制靜態(tài)解吸曲線，選擇最佳解吸劑。

式中：c為吸附前溶液的黃酮質(zhì)量濃度；c′為吸附后溶液的黃酮質(zhì)量濃度；V為吸附液的體積；c″為解吸液的黃酮質(zhì)量濃度；V′為解吸液的體積。

1．2．2．4 動態(tài)吸附－解吸實驗［6－8］

將已處理好的X－5大孔吸附樹脂濕法裝柱，徑高比為1cm∶10cm。在靜態(tài)吸附實驗、解吸實驗基礎(chǔ)上，將一定質(zhì)量濃度、一定pH值黃酮粗提液以1mL·min－1的流速上柱，充分吸附飽和后，用4BV去離子水沖洗，然后依次用靜態(tài)解吸優(yōu)選出的最佳解吸劑進行洗脫（洗脫流速1mg·min－1）。收集解吸液，測定吸光度，計算黃酮質(zhì)量濃度。

1．2．3 黑柴胡黃酮質(zhì)量濃度的測定

參照文獻［9］，采用 NaNO2－Al（NO3）3－NaOH 法，以蘆丁為基準物質(zhì)測定黑柴胡黃酮的質(zhì)量濃度。擬合標準曲線的回歸方程為A＝11．079c－0．029［A為吸光度 值、c 為黃酮質(zhì)量 濃 度 （mg·mL－1）］，R2＝0．99987，線性范圍為0．0094～0．0564mg·mL－1。

移取0．1mL黑柴胡黃酮液于25mL容量瓶中，按照標準曲線測定方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算黑柴胡黃酮質(zhì)量濃度。

1．2．4 黑柴胡黃酮抗氧化性研究

1．2．4．1 黑柴胡黃酮對·DPPH的清除作用

參照文獻［10］，方法略有改動：分別移取純化前后不同質(zhì)量濃度黃酮液1．00mL于試管中，加入100μg·mL－1的·DPPH溶液1．00mL，補水至5mL，避光放置30min后在517nm下測定吸光度Ai，以相同質(zhì)量濃度的Vc、BHA作陽性對照。按式（3）計算清除率：

式中：A0為未加黃酮液的·DPPH溶液的吸光度；Aj為相應(yīng)質(zhì)量濃度黃酮液的本底吸光度。

1．2．4．2 黑柴胡黃酮對ABTS＋的清除作用

參照文獻［11］方法，配制ABTS＋工作液。分別移取純化前后不同質(zhì)量濃度黃酮液1．00mL于試管中，加入2．00mL ABTS＋工作液，補水至5mL，室溫放置20 min后，于734nm處測定吸光度A′i。以相同質(zhì)量濃度的Vc、BHA作陽性對照。按式（4）計算清除率：

1．2．4．3 黑柴胡黃酮還原力的測定

參照文獻［12］方法進行測定，以Vc、BHA作陽性對照，測定700nm處吸光度。

2 結(jié)果與討論

2．1 黑柴胡黃酮粗提液的質(zhì)量濃度

根據(jù)1．2．1方法做平行實驗3次，黑柴胡黃酮粗提液的平均質(zhì)量濃度為10．75mg·mL－1，RSD為0．16%。

2．2 黃酮粗提液pH值對吸附率的影響（圖1）

圖1 pH值對吸附率的影響Fig．1 The effect of pH value on adsorption rate

由圖1可知，pH值在1～2之間的吸附率較高，隨著pH值的增大，吸附率降低。這是因為，黃酮為多羥基酚類，呈現(xiàn)一定的弱酸性，在酸性條件下以分子狀態(tài)存在，主要以范德華力被樹脂物理吸附，而在堿性條件下，黃酮可形成佯鹽，以離子形式存在，不易被樹脂吸附［13］，吸附率降低。因此，選擇適宜的黃酮粗提液pH值為2。

2．3 靜態(tài)吸附動力學曲線（圖2）

由圖2可知，X－5大孔吸附樹脂可在短時間內(nèi)達到較大吸附量，吸附3h時的樹脂吸附率達到85．85%；吸附7h時，吸附趨于飽和。因此，選擇適宜的靜態(tài)吸附時間為7h。

2．4 靜態(tài)吸附等溫曲線（圖3）

由圖3可知，粗提液中黃酮質(zhì)量濃度對吸附率的影響較大。當黃酮質(zhì)量濃度為0．369mg·mL－1時，吸附率達到最大值93．58%；繼續(xù)增大黃酮質(zhì)量濃度，吸附率有所減小。這是因為，黃酮濃度較大時，因其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、羰基官能團［14］，易于形成氫鍵而成為聚合大分子，不易被吸附。因此，選擇黃酮粗提液最佳上樣濃度為0．369mg·mL－1。

2．5 解吸劑篩選

考察乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響Fig．4 The effect of ethanol volume fraction on desorption rate

由于黃酮類化合物大多為極性且其極性范圍較廣［14］，根據(jù)“相似相容”原理，不同極性的黃酮化合物應(yīng)溶于不同體積分數(shù)的乙醇中。由圖4可知，不同體積分數(shù)的乙醇對飽和樹脂的解吸能力不同，45%乙醇解吸效果最好（解吸率92．54%），65%乙醇次之（解吸率87．73%）。因此，選擇45%、65%乙醇作為動態(tài)解吸劑。

2．6 動態(tài)洗脫曲線（圖5）

圖5 動態(tài)洗脫曲線Fig．5 Dynamic curves of ethanol desorption

由圖5可知，45%乙醇洗脫完全需70mL，65%乙醇洗脫完全需75mL。45%乙醇洗脫液和65%乙醇洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度分別為1．323mg·mL－1和0．1183mg·mL－1。

2．7 純化前后黑柴胡黃酮抗氧化能力

2．7．1 黑柴胡黃酮對·DPPH的清除作用

·DPPH是一種較穩(wěn)定的自由基，當加入樣品后，若含有抗氧化物質(zhì)提供電子與·DPPH配對使其顏色變淺，通過褪色程度就可以衡量清除活性的大小［15］。測定不同質(zhì)量濃度黑柴胡黃酮液及對照的·DPPH清除能力及IC50值，結(jié)果見圖6和表1。

圖6 清除·DPPH能力Fig．6 The ability of scavenging·DPPH

由圖6可知，在實驗范圍內(nèi)，隨著各樣品質(zhì)量濃度的增大，·DPPH清除率均呈遞增趨勢，但45%乙醇洗脫液、65%乙醇洗脫液和粗提液與對照相比，增加緩慢。

由表1可知，由IC50值確定的清除·DPPH能力大小依次為：BHA＞Vc＞45%乙醇洗脫液＞65%乙醇洗脫液＞粗提液，45%乙醇洗脫液和65%乙醇洗脫液較粗提液半數(shù)清除率分別提高了44．56%、24．70%，說明45%乙醇洗脫液含有清除·DPPH成分多于65%乙醇洗脫液。

表1清除·DPPH的IC50值Tab．1 The IC50values for scavenging·DPPH

2．7．2 黑柴胡黃酮對ABTS＋的清除作用

ABTS＋是一種經(jīng)氧化后形成的綠色自由基，當加入樣品后，若含有抗氧化物質(zhì)提供供氫體使其顏色變淺，其褪色程度與抗氧化劑濃度呈正相關(guān)［15］。測定不同黑柴胡黃酮液及對照的清除ABTS＋能力和IC50值，結(jié)果見圖7和表2。

由圖7可知，各樣品清除ABTS＋能力與質(zhì)量濃度均呈正相關(guān)，而且純化后黃酮液清除ABTS＋能力強于對照。

圖7 清除ABTS＋能力Fig．7 The ability of scavenging ABTS＋

由表2可知，由IC50值確定的清除ABTS＋能力大小為：65%乙醇洗脫液＞45%乙醇洗脫液＞Vc＞粗提液＞BHA，45%乙醇洗脫液和65%乙醇洗脫液較粗提液半數(shù)清除率分別提高了33．91%、51．66%，說明65%乙醇洗脫液含有清除ABTS＋成分多于45%乙醇洗脫液。此外，45%乙醇洗脫液、65%乙醇洗脫液和粗提液的清除ABTS＋能力均顯著強于其清除·DPPH能力。

表2清除ABTS＋的IC50值Tab．2 The IC50values for scavenging ABTS＋

2．7．3 黑柴胡黃酮的還原力（圖8）

在還原力測定中，吸光度越大表明抗氧化性越強，還原力越強［16］。由圖8可知，在實驗測定范圍內(nèi)，各樣品還原力與質(zhì)量濃度均呈正相關(guān)。還原力大小依次為：Vc＞45%乙醇洗脫液＞BHA＞65%乙醇洗脫液＞粗提液，45%乙醇洗脫液和65%乙醇洗脫液較粗提液還原力分別提高了47．80%、23．59%，說明X－5大孔吸附樹脂是分離純化黑柴胡黃酮的優(yōu)良樹脂。

圖8 還原力Fig．8 The reducing ability

3 結(jié)論

（1）X－5大孔吸附樹脂對黑柴胡黃酮有較好的吸附和解吸效果。其最佳靜態(tài)吸附條件為：粗提液中黃酮上樣濃度為0．369mg·mL－1、pH 值1～2、吸附時間為7h，最大吸附率達到93．58%；45%乙醇、65%乙醇靜態(tài)解吸效果相對較好，解吸率分別為92．54%、87．73%；45%乙醇、65%乙醇動態(tài)洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度分別為1．323mg·mL－1、0．1183mg·mL－1。

（2）考察了純化前后黑柴胡黃酮的抗氧化性。由IC50值可知，清除·DPPH的能力大小依次為：45%乙醇洗脫液＞65%乙醇洗脫液＞粗提液，清除ABTS＋的能力大小依次為：65%乙醇洗脫液＞45%乙醇洗脫液＞粗提液，還原力大小依次為：45%乙醇洗脫液＞65%乙醇洗脫液＞粗提液；45%乙醇洗脫液、65%乙醇洗脫液和粗提液的清除·DPPH能力均顯著弱于其清除ABTS＋能力；45%乙醇洗脫液、65%乙醇洗脫液抗氧化能力均強于粗提液，說明X－5大孔吸附樹脂是分離純化黑柴胡黃酮的優(yōu)良樹脂。

［1］雷嵐芬，孟祥龍．黑柴胡與柴胡的生藥學比較研究［J］．山西中醫(yī)學院學報，2011，12（5）：21－22．

［2］李淑珍，李進，楊志江，等．大孔樹脂分離純化黑果枸杞總黃酮的研究［J］．食品科學，2009，30（1）：19－24．

［3］李晨，姜子濤，李榮．大孔吸附樹脂純化櫻桃葉中總黃酮的研究［J］．食品科技，2012，37（9）：212－217．

［4］仰榴青，徐佐旗，茆廣華，等．大孔吸附樹脂純化銀杏外種皮多糖的研究［J］．中藥材，2006，29（10）：1098－1100．

［5］陸世惠，龍盛京．D－101大孔樹脂分離純化兩面針總生物堿［J］．西北藥學雜志，2013，28（1）：7－9．

［6］張勇，李彩霞，麻貝貝，等．大孔吸附樹脂純化“黑美人”土豆色素研究［J］．食品工業(yè)科技，2012，33（2）：345－348．

［7］洪雪娥，高蔭榆，羅麗萍，等．大孔樹脂對薯蔓黃酮吸附分離特性研究［J］．食品科學，2006，27（10）：423－427．

［8］汪茜，何宇新，鄧蕓．大孔吸附樹脂純化貫葉連翹總黃酮工藝研究［J］．成都醫(yī)學院學報，2008，3（4）：256－258．

［9］齊柳婭，郁建平，田晶，等．大孔吸附樹脂分離純化追風傘總黃酮的研究［J］．化學與生物工程，2010，27（1）：37－40．

［10］袁王俊，李彩芳，丁秋瑾，等．黃連抗氧化活性研究［J］．廣西植物，2009，29（5）：694－697．

［11］廖月霞，王笑娜，孔桂美，等．半枝蓮乙醇提取物體外抗氧化活性研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2012，23（3）：520－522．

［12］王芙蓉，吳冬青，安紅鋼，等．當歸總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究［J］．中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010，29（5）：11－15．

［13］張斌，孫蘭萍，馬龍，等．大孔吸附樹脂分離純化花生殼總黃酮的研究［J］．中國糧油學報，2010，25（2）：126－130．

［14］郭雪峰，岳永德．黃酮類化合物的提取·分離純化和含量測定方法的研究進展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（26）：8083－8086．

［15］趙曉莉，陳衛(wèi)軍，趙松林，等．椰子種皮油提取物的抗氧化活性研究［J］．熱帶作物學報，2012，33（1）：162－165．

［16］馬利華，賀菊萍，秦衛(wèi)東，等．槐花提取物抗氧化性能研究［J］．食品科學，2007，28（9）：75－77．