高效液相色譜法測定甲磺酸伊馬替尼的含量和有關物質

劉 娥

（荊楚理工學院化工與藥學院，湖北 荊門448000）

甲磺酸伊馬替尼（Imatinib mesylate），商品名格列衛，是瑞士諾華公司研發的一種酪氨酸激酶抑制劑，是第一個以蛋白激酶抑制作用模式發揮信號傳感抑制劑作用的上市藥物。2001年5月10日獲得美國食品與藥品管理局（FDA）的批準，用于治療α－干擾素（Interfereon－alfa）治療無效的胚細胞危象病期、加速病期或慢性病期的慢性骨髓性白血病患者［1］，并以高效、低毒、針對性強的抗癌靶向性，取得了顯著療效，開啟了腫瘤分子靶向治療的新時代［2］。目前，甲磺酸伊馬替尼的合成及其作用機制的研究較多［3－6］，而對于其原料藥的質量控制的研究并不多見。作者參照有關物質的測定方法［7－9］，建立了測定甲磺酸伊馬替尼的含量和有關物質的HPLC方法。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

甲磺酸伊馬替尼對照品，中國藥品生物制品檢定所；甲磺酸伊馬替尼原料藥（20121103、20121105、20121108），自制。

Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計；CP－224S型電子分析天平，德國賽多利斯；Milli－Q型超純水機，美國Millipore公司。

1．2 方法

1．2．1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（150mm×4．6mm，5 μm）；流動相：辛烷磺酸鈉和磷酸二氫鉀的緩沖溶液（pH值3．0）∶甲醇＝45∶55（體積比，下同），流速1．0 mL·min－1，檢測波長285nm，柱溫30℃。

1．2．2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥的甲磺酸伊馬替尼對照品25．0mg，置于100mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成0．25mg·mL－1的甲磺酸伊馬替尼對照品儲備液。精密量取1．0mL甲磺酸伊馬替尼對照品儲備液，加甲醇稀釋至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得濃度為2．5μg·mL－1的對照品溶液，備用。

1．2．3 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的甲磺酸伊馬替尼原料藥25．0mg，置于100mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成0．25mg·mL－1的甲磺酸伊馬替尼供試品儲備液。精密量取1．0mL甲磺酸伊馬替尼供試品儲備液，加甲醇稀釋至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得濃度為2．5μg·mL－1的供試品溶液，備用。

2 結果與討論

2．1 色譜條件的選擇

2．1．1 檢測波長的選擇

稱取甲磺酸伊馬替尼對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為10μg·mL－1的溶液，經紫外分光光度計掃描，甲磺酸伊馬替尼在285nm處有最大吸收，故選取285nm為檢測波長。

2．1．2 流動相的選擇

實驗中分別選取甲醇－乙腈、甲醇－三乙胺、甲醇－磷酸鹽緩沖溶液（不同比例）作為流動相，結果發現，采用辛烷磺酸鈉和磷酸二氫鉀的緩沖溶液（pH值3．0）∶甲醇＝45∶55作為流動相，分離效果較好，故采用辛烷磺酸鈉和磷酸二氫鉀的緩沖溶液（pH值3．0）∶甲醇＝45∶55為流動相。

2．2 分離專屬性

稱取甲磺酸伊馬替尼對照品適量，加流動相溶解并配制成濃度為0．1mg·mL－1的溶液。取5mL該溶液各4份，分別加1mol·L－1氫氧化鈉溶液、1mol·L－1鹽酸溶液、30%過氧化氫溶液各2mL、100℃水浴加熱1h，中和后加流動相至10mL，進樣，考察降解物的分離性能，色譜圖見圖1。

圖1 破壞性實驗的HPLC圖譜Fig．1 Chromatograms of stress conditions experiment

由圖1可知，各峰分離良好，表明方法的分離專屬性好。

2．3 線性關系

分別精密量取1．0mL、2．0mL、3．0mL、4．0mL、5．0mL甲磺酸伊馬替尼對照品儲備液，加甲醇稀釋至10mL容量瓶中，定量，搖勻。分別取以上溶液各10 μL進樣測定，以峰面積（y）為縱坐標、濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，擬合得回歸方程y＝1542．2x＋2．216，R＝0．9999，結果表明濃度在2．5～12．5μg·mL－1范圍內與峰面積線性關系良好。

2．4 檢測限

精密量取甲磺酸伊馬替尼對照品溶液加甲醇稀釋制成一系列濃度溶液，取10μL注入液相色譜儀，當主成分峰高為最大噪音峰高的3倍時，進樣量即為檢測限，結果為0．5ng。

2．5 精密度

在相同色譜條件下，精密量取濃度為2．5μg·mL－1的甲磺酸伊馬替尼對照品溶液10μL，連續進樣5次，測定峰面積為3782．6、3779．9、3788．5、3781．2、3789．7，平均峰面積為3784．38，方法的RSD（n＝5）為0．11%，表明方法的精密度良好。

2．6 穩定性

在相同色譜條件下，精密量取同一批號濃度為2．5 μg·mL－1的甲磺酸伊馬替尼供試品溶液10μL，分別于0h、2h、4h、6h、8h、12h進樣，測定峰面積為3768．5、3782．1、3779．6、3780．2、3772．3、3765．4，平均峰面積為3774．68，方法的 RSD（n＝6）為0．18%，表明供試品溶液在12h內穩定。

2．7 重復性

在相同的色譜條件下，精密量取同一批號濃度為2．5μg·mL－1的甲磺酸伊馬替尼供試品溶液10μL，進樣，平行測定6次，RSD為0．68%（n＝6），表明方法的重復性良好。

2．8 加樣回收率

精密量取濃度為0．25mg·mL－1的甲磺酸伊馬替尼對照品儲備液1mL、2mL、3mL各2份，分別精密加入原料藥粉末約0．5mg，按1．2．3方法制備供試品溶液，取10μL進樣測定，結果見表1。

表1 回收率實驗結果Tab．1 Results of recovery rate experiment

由表1可知，方法的平均回收率為99．85%（n＝6）。

2．9 原料藥的測定

精密稱取3批甲磺酸伊馬替尼原料藥25mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻；分別精密量取1．0mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取濾液10μL，進樣測定，記錄色譜圖。另取甲磺酸伊馬替尼對照品25mg，同法進行測定，結果見表2。

3 結論

建立了測定甲磺酸伊馬替尼原料藥含量和有關物質的HPLC方法。確定色譜條件為：Diamonsil C18色譜柱（4．6mm×150mm，5μm），柱溫30℃，流動相：辛烷磺酸鈉和磷酸二氫鉀的緩沖溶液（pH值3．0）∶甲醇＝45∶55，流速1．0mL·min－1，檢測波長285 nm。結果表明，甲磺酸伊馬替尼濃度在2．5～12．5μg·mL－1范圍內與峰面積線性關系良好，平均加樣回收率為99．85%（n＝6）。該方法操作簡便、快速、靈敏、準確，樣品處理容易，可用于甲磺酸伊馬替尼的含量和有關物質的檢測。

表2 原料藥中甲磺酸伊馬替尼含量和有關物質的測定結果／%Tab．2 Determination results of content and related substances of imatinib mesylate／%

［1］陳敖，黃荷香，宋帥娟，等．甲磺酸伊馬替尼的合成［J］．精細與專用化學品，2007，15（8）：23－25．

［2］宋耕，軒菡，王年飛，等．甲磺酸伊馬替尼的臨床應用研究［J］．中華臨床醫師雜志，2011，5（24）：7348－7350．

［3］李銘東，李東，吉民．甲磺酸伊馬替尼的合成［J］．中國藥學雜志，2008，43（3）：228－229．

［4］陳靈娟，周和平，黃文峰，等．甲磺酸伊馬替尼的合成［J］．河北科技大學學報，2011，32（5）：492－495．

［5］Manley P W，Breitenstein W，Brüggen J，et al．Urea derivatives of STI571as inhibitors of Bcr－Abl and PDGFR kinases［J］．Bioorg Med Chem Lett，2004，14（23）：5793－5797．

［6］Wojciech S，Wojciech L，Lukasz K，et al．A process for preparation of imatinib base［P］．WO 2006 071 130，2006－11－16．

［7］劉海燕，崔艷，嚴拯宇．HPLC法測定鹽酸羥嗪含量及有關物質［J］．海峽藥學，2009，21（12）：59－61．

［8］杜寧，周艷麗．HPLC法測定那格列奈含量及有關物質［J］．江蘇藥學與臨床研究，2006，14（4）：238－240．

［9］王棋，宋銳，費夢瑩，等．梯度洗脫HPLC法測定甲磺酸伊馬替尼含量及有關物質［J］．海峽藥學，2012，24（3）：58－60．