黃粉蟲纖溶酶的三維結構模擬與序列分析

余 磊，韓雅莉

（1．武漢軟件工程職業學院，湖北 武漢430205；2．廣東工業大學，廣東 廣州510006）

黃粉蟲（Tenebrio molitor）俗稱黃粉甲、面包蟲，原產于南美洲，屬于倉庫和貯藏害蟲。因其營養成分高，營養含量居各類活體動物蛋白飼料之首，被譽為“蛋白質飼料寶庫”。作者所在課題組從黃粉蟲體內分離純化得到黃粉蟲纖溶酶［1，2］，對其基因DNA序列進行了分析，克隆得到其中一種黃粉蟲纖溶酶成熟肽cDNA序列（GenBank登錄號：JN662461），并將其表達［3］。在此，利用生物信息學方法，對黃粉蟲纖溶酶序列進行多方位分析、確定活性中心的位置，建立了可靠的黃粉蟲纖溶酶三維結構模型，并揭示了黃粉蟲纖溶酶的纖溶機理。

1 方法

要想了解蛋白質的立體結構，需要將蛋白質溶液結晶，用X－射線衍射分析蛋白質的單晶才能完成。但是蛋白質結晶條件苛刻，而且不是所有蛋白質都能形成單晶，因此實施起來受到限制。利用現代計算機技術，人們可以對已知氨基酸序列的蛋白質三維結構進行預測，同時還能對蛋白質序列中的每一個氨基酸逐個分析。因此，比較蛋白質模建，又稱同源模建，逐漸成為目前應用最廣的蛋白質三維結構預測方法［4－6］。

將黃粉蟲纖溶酶的序列提交到NCBI的自動比較蛋白質模建服務器Blast上，通過程序，自動確定黃粉蟲纖溶酶序列活性中心與底物結合部位；將黃粉蟲纖溶酶蛋白質序列導入Biosun軟件，軟件自動選取蛋白質Tryp＿SPc［cd00190］為模板，模擬得到黃粉蟲纖溶酶的三維結構，并利用Blast比較模板蛋白與黃粉蟲纖溶酶的同源性；利用Goldkey軟件，對黃粉蟲纖溶酶全序列等電點、親水性、柔性進行分析，基于無模型比對時活性中心氨基酸殘基的性質，進一步闡明黃粉蟲纖溶酶的纖溶機理。

2 結果與討論

2．1 黃粉蟲纖溶酶序列分析（圖1）

圖1 黃粉蟲纖溶酶序列分析Fig．1 The sequence analysis of fibrinolysin fromTenebrio molitor

由圖1可知，黃粉蟲纖溶酶序列的活性中心（Active sites）為 H72、D117、S212，底物結合部位（Substrate binding sites）為：D207、S228、G230。

2．2 三維結構模擬與評估

黃粉蟲纖溶酶的模擬三維結構見圖2，模板蛋白和黃粉蟲纖溶酶的同源性比較見表1。

圖2 黃粉蟲纖溶酶模擬三維結構Fig．2 The analogous 3D－structure of fibrinolysin from Tenebrio moliter

圖2中，a、b、c 3個球狀模型，分別對應黃粉蟲纖溶酶的活性中心S212、H72、D117三個氨基酸殘基側鏈：羥基、咪唑基、羧基，與胰蛋白酶催化三聯體結構一致［7，8］。d、e、f三處肽鍵鏈狀模型，分別對應黃粉蟲纖溶酶的底物結合部位D207、S228、G230。由三維結構可以看出底物結合部位和活性中心均沒有α－螺旋和β－折疊（α－螺旋為柱狀區，β－折疊為板狀區），該區域容易發生形變，在催化過程中與底物結合時，產生誘導契合，符合酶催化理論；酶活中心處于蛋白質中心凹穴處，與通常對纖溶酶活性中心的認識一致［9，10］。本課題組前期研究中曾發現黃粉蟲纖溶酶受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的抑制，推測其為絲氨酸蛋白酶［2，3］，此推測與生物信息學方法找到的活性中心S212相吻合。

黃粉蟲纖溶酶的序列為：MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPA－LRSYIQQTAGI。

模板蛋白序列為：IVGGSEAKIGSFPWQVSLQYTGGRHFCGGSLISPRWVLTAAHCVYSSAPSNYTVRLGSHDLSSNEGGGQVIKVKKVIVHPNYNPSTYDNDIALLKLKRPVTLSDNVRPICLPSSGYNLPAGTTCTVSGWGRTSEGGPLPDVLQEVNVPIVSNAECKRAYSYGGTITDNMLCAGGLEGGKDACQGDSGGPLVCNDNGRGVLVGIVSWGSGCARPNYPGVYTRVSSYLDWIQKT。

表1 模板蛋白和目的蛋白同源性比較Tab．1 The homology comparison between the template protein and the target protein

由表1可知，Blast評分為186，說明模板蛋白和目的蛋白的同源性比較高；序列覆蓋率達到了94%；隨機匹配的可能性非常小，僅為2E－62，說明兩個蛋白出現相同的序列并非偶然；最大序列的相似度達到51%。表明，以此模板蛋白進行同源模建，所得結構是比較可信的。

2．3 Goldkey軟件的序列分析

在黃粉蟲纖溶酶三維結構分析中，采用的是同源模建的方法。預測過程中，其它蛋白質與目標預測物的差異，會導致一定程度的偏差。采用Goldkey軟件對序列的每個殘基逐個計算其特性，雖然無法得到三維結構，但是其數據可靠性更好，更能反映目標蛋白質的特性。用Goldkey軟件分別對黃粉蟲纖溶酶氨基酸序列進行等電點模擬、親水性模擬、柔性模擬，結果見圖3。

由圖3a可知，黃粉蟲纖溶酶的等電點為9．16，在人體內正常生理環境下，該酶帶正電。而纖維蛋白通常帶負電荷，所以黃粉蟲纖溶酶很容易靠近纖維蛋白，并與之結合。因此，黃粉蟲纖溶酶對血栓有一定的靶向作用。

對于水溶性球形蛋白，親水值較低的氨基酸，趨向于蛋白質的內部，親水值較高的氨基酸，趨向于蛋白質的外部。由圖3b可知，H72、S212、D207親水值較低，而且H72和D207是局部親水值最低點，應該在球蛋白內部；S228、G230親水值較高，應該在球蛋白外部，與三級結構相符。

圖3 等電點模擬（a）、親水性模擬（b）和柔性模擬（c）Fig．3 The isoelectric point analogue（a），hydrophilicity analogue（b）and flexibility analogue（c）

由圖3c可知，活性部位H72、D117、S212的柔性值比較小，幾乎是整條鏈上最小的區域，說明組成酶活性中心的3個氨基酸殘基的空間位置相對固定，因而活性中心的相對結構很穩定，在自然狀態下不會隨意發生變形，底物結合部位中S228、G230的柔性值比較小，說明這兩個殘基的空間相對位置比較固定，D207的柔性值比較大，這符合酶促反應動力學誘導契合理論。在結合底物時，酶的結合部位和底物的結構都發生了一定的形變（柔性才能形變），兩者在空間結構上剛好互補，從而能很好地契合。全鏈柔性分析表明，黃粉蟲纖溶酶的活性中心和底物結合部位符合酶催化機理，從另一側面證明了活性中心預測的準確性。

2．4 纖維蛋白水解部位結構分析

體內纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用于精氨酸－賴氨酸肽鍵，使之斷裂的過程［11，12］。

3 結論

利用生物信息學方法，模擬黃粉蟲纖溶酶的三維結構，并對其全序列進行了分析。確定黃粉蟲纖溶酶的活性中心為 H72、D117、S212，底物結合部位為D207、S228、G230。黃粉蟲纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測其催化纖維蛋白水解的機理是作用于精氨酸－賴氨酸肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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