脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的快速分離純化及其抗體制備

洪淑娟，傅堅英，曹 娟，喻子牛，張吉斌（華中農業大學 農業微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢430070）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素［1］，為雪腐鐮刀菌烯醇（Nivalenol，NIV）的4－脫氧衍生物，屬于單端孢霉烯族化合物。現已證實，禾谷鐮刀菌、擬枝鐮刀菌、梨孢鐮刀菌等多種鐮刀菌株以及頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等真菌都可產生DON［2］。

DON是一種霉菌毒素（Mycotoxin），對糧食、飼料和食品的污染非常普遍，對該毒素進行分離檢測十分重要。由于目前市場上DON供應少，購買困難且價格昂貴，因此，有必要建立有效的DON分離純化方法，為相關研究提供材料。真菌代謝毒素物質的分離純化方法主要采用凝膠色譜法、硅膠層析法、離子交換法等，一般存在耗時長、回收率不高或一次處理樣品量少等缺點。高速逆流色譜法（High－speed counter－current chromatography，HSCCC）［3－5］不使用固相載體作固定相，不僅費用低，避免了固相載體帶來的樣品預處理要求高、因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活變性等問題［6，7］，而且回收率高、分離量大。

免疫原的分子量一般在40 000以上。小分子物質的抗體制備相對于完全抗原來說較難。分子量小于5000的物質（半抗原）不足以達到刺激機體產生相應抗體的要求，需要與載體蛋白偶聯后才具有免疫原性［8］。目前，對于分子中含有－COOH或可羧化的－OH的半抗原的偶聯方法通常是：加入琥珀酸酐使－OH乙?；珊恤然陌肟乖?，再在碳化二亞胺（DCC）催化下，與載體蛋白的氨基反應，制備完全抗原。

作者將高速逆流色譜法與高效液相色譜法相結合，快速從禾谷鐮刀菌固體發酵產物中分離純化DON，并將得到的高純度DON用于其抗體制備。

1 實驗

1．1 動物、試劑與儀器

雌性Balb／C小鼠，編號1＃～3＃。

乙酸乙酯（分析純），甲醇（色譜純），蒸餾水，4－二甲氨基吡啶（DMAP），琥珀酸酐（HS），牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑，DON標準品（Sigma－Aldrich公司），四甲基聯苯胺（TMB）底物A液和B液。

TBE－300A型高速逆流色譜儀，上海同田生化技術有限公司；ATKA Prime泵系統、檢測系統及組分收集系統；溫控恒溫水浴鍋，北京博康醫療器械有限公司；LC－2010型高效液相色譜儀，日本島津；旋轉蒸發儀，上海申生；冷凍干燥機、超凈工作臺，上海博訊；ZDX－35BI型蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；生化恒溫培養箱，黃石恒豐醫療器械有限公司；離子阱－飛行時間液質聯用儀（LC／MS IT－TOF）；基質輔助激光解吸附電離串聯飛行時間質譜儀（MALDI－TOFMS）。

1．2 菌株與培養基

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）R6576，由西北農林科技大學真菌研究所提供。

PDA固體培養基：蔗糖2g，馬鈴薯20g，瓊脂粉1．5g，蒸餾水100mL。

CMC液體培養基：纖維素1．5g，硝酸銨0．02g，酵母抽提物0．1g，蒸餾水100mL。

大米培養基：大米100g，蒸餾水50mL。

1．3 DON粗提物的制備

（1）菌株培養：挑取少量禾谷鐮刀菌菌塊于PDA固體培養基中央，在28℃、相對濕度75%條件下培養3～5d，菌絲呈白色，中央菌塊呈玫瑰色。

（2）孢子液的制備：挑取上述菌絲接種于100mL CMC液體培養基，置于28℃、200r·min－1的搖床培養，期間顯微鏡觀察，直至孢子部分或完全釋放后，即制得孢子液。

（3）固體發酵：接種1%（質量體積比）的上述孢子液于已滅菌的3瓶大米培養基內，攪拌均勻后，置于28℃恒溫培養箱培養，使大米最大程度地被真毒侵染，并不定期攪拌，使菌體均衡生長。

（4）DON粗提物的制備：向發酵的大米培養基內加入600mL甲醇，室溫下搖床振蕩過夜后，收集濾液，于40℃旋轉蒸發濃縮以除去甲醇和大部分水，濃縮液再進行真空冷凍干燥后，作為高速逆流色譜的樣品，－20℃保存備用。

1．4 高速逆流色譜法分離

分別將500mL乙酸乙酯、500mL水加入到分液漏斗中，搖勻后靜置分層，上相作為固定相、下相作為流動相。將固定相以30mL·min－1的流速泵入高效逆流色譜儀主機的螺旋柱中，直至固定相流出達到平衡后，以正轉轉速890r·min－1［9］、流速1mL·min－1泵入樣品。將DON粗提物溶于20mL流動相中，注入樣品環，采用紫外檢測器（檢測波長為254nm）監測，根據色譜圖收集各餾分。

1．5 高效液相色譜法分離和分析

采用高效液相色譜儀對經高速逆流色譜分離后各餾分進行純化；通過比較待鑒定化合物與DON標準品色譜峰的保留時間進行定性。

色譜條件：Waters Symmetry C18色譜柱（5μm，4．6mm×250mm），流動相為甲醇－水（2∶8，體積比），檢 測 波 長2 1 8nm，流 速1mL·min－1，柱 溫25．0℃。

1．6 DON人工抗原合成

（1）半抗原DON－HS的合成

稱取7mg DON、85mg HS、2mg DMAP于1．5 mL 離心管內［10，11］，加入1．2mL 脫水丙酮，并充分振蕩使其完全溶解，置于80℃水浴鍋反應4h（期間間歇補加脫水丙酮），反應結束后氮氣吹干剩余丙酮；加入400μL蒸餾水，超聲溶解管內物質，再加入800μL乙酸乙酯，充分混合后，超聲溶解15min，保留含DONHS的乙酸乙酯層［12］。

（2）人工抗原 DON－BSA的合成

稱取10mg BSA溶于2．5mL 0．13mol·L－1的NaHCO3溶液中，置于磁力攪拌器上，攪拌下加入DON－HS，于4℃ 反應20h，將反應液置于0．01mol·L－1PBS（pH 值7．4）中透析3d，期間每隔24h換液1次，透析后的物質即為免疫原DON－BSA，真空冷凍干燥，于－20℃保存備用。

包被原DON－OVA的合成方法同免疫原。

1．7 MALDI－TOF－MS質譜鑒定DON人工抗原

將DON－BSA偶聯物用超純水溶解成濃度為1mg·mL－1的樣品，進行 MALDI－TOF－MS質譜鑒定。質譜條件：采樣方法為線性高分子量陽離子模式，處理方法為線性高分子量內標法，激光強度為4500，分子量范圍為20 000～100 000Da，采樣次數為800次，上樣量為0．3μL，MALDI基質為alpha－Cyano－4－hydroxy－cinnamic。

1．8 多克隆抗體制備、效價測定

取6～8周齡、體重20g左右的雌性Balb／C小鼠3只，將免疫原DON－BSA稀釋至1mg·mL－1，與福氏完全佐劑以1∶1的比例乳化，經腹腔和皮下多點注射。初次免疫劑量為每只250μg。以后每隔14d免疫1次，免疫方法同初次免疫，但所用免疫原采用福氏不完全佐劑乳化。采用眼眶靜脈叢采血，采第3次免疫血清，4℃過夜后，離心，收集上清，于－20℃保存備用。

采用間接酶聯免疫分析法（C－ELISA）測定多克隆抗體的效價，具體步驟如下：（1）用pH值9．6的0．05 mol·L－1碳酸鹽緩沖溶液稀釋DON－OVA至終濃度為20μg·mL－1，包被酶標板，每孔100μL，4℃過夜；（2）PBST洗滌3次，用0．5%的卵清蛋白溶液封阻，每孔200μL，37℃孵育1h，PBST洗滌4次，拍干；（3）將小鼠多克隆抗體及陰性血清稀釋成以下濃度：1∶4000、1∶10 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000，每孔100μL橫向加入孔內，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，拍干；（4）加入 HRP－標記羊抗鼠二抗IgG（1∶3000稀釋度），每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，每次3min，拍干；（5）等體積混合TMB底物A液和B液，盡快加入酶標板孔內，每孔100μL，37℃顯色5min，加2mol·L－1H2SO4溶液終止，每孔50 μL，設置酶標儀波長450nm，讀數；（6）結果判定：P／N≥2．0，判為陽性（P、N分別為實驗組小鼠和陰性小鼠血清的OD450值）。呈陽性時，血清的最大稀釋倍數即為該血清的效價。

2 結果與討論

2．1 高速逆流色譜分離結果（圖1）

圖1 DON粗提物的高速逆流色譜Fig．1 The high－speed counter－current chromatogram of crude extract of DON obtained

由圖1可知，DON粗提物經高速逆流色譜分離后，有兩個主要的色譜峰（A和B），將A、B所分布時間段的餾分合并，分別命名為餾分A、餾分B。色譜峰A峰形不規則，說明其應該由多種化合物產生，而色譜峰B規則、對稱，說明其有可能由單一的化合物產生。根據高速逆流色譜在正轉工作模式下，極性較大的化合物先出峰的原理，初步判定DON有可能存在于餾分B中。

2．2 高效液相色譜分離和分析結果

將高速逆流色譜分離收集得到的各餾分再分別經高效液相色譜分離。結果只有餾分B的高效液相色譜（圖2）中具有與DON標準品相同保留時間的色譜峰，據此，可以初步判斷餾分B中含有DON。收集含有DON色譜峰的餾分，真空冷凍干燥后，得到DON純化樣品。該純化樣品中含有的化合物主要為DON（圖2）。

通過外標法定量分析，從300g大米發酵培養物中共得到8mg DON純化樣品，純度為97．7%。

圖2 標準品、純化樣品和餾分B的高效液相色譜Fig．2 The HPLC spectra of standard，purified sample and distillation cut B

2．3 LC／MS IT－TOF質譜鑒定半抗原合成

DON分子量為296．1，羥基進行隨機乙酰化后進行LC／MS IT－TOF檢測，結果見圖3。

圖3 DON－HS的LC／MS IT－TOF質譜圖Fig．3 The LC／MS IT－TOF pattern of DON－HS

由圖3可知，質荷比［M－H］＋＝495．1440，表明DON分子連有2個琥珀酸酐分子，質荷比［M－H］＋＝395．1274，表明DON分子連有1個琥珀酸酐分子，證明成功合成了半抗原DON－HS。

2．4 MALDI－TOF－MS質譜鑒定DON－BSA（圖4）

由圖4可知，DON－BSA人工抗原的分子量約71304．42Da，相對于蛋白BSA的分子量（66442．9375 Da）有很大的增加，表明有大量的DON分子被偶聯在BSA上了，這就大大提高了實驗動物產生針對DON的抗體的成功率。

2．5 多克隆抗體效價（表1）

由表1可知，間接酶聯免疫分析法測定小鼠多克隆抗體效價，1＃和3＃小鼠的效價均為1∶32 000，2＃小鼠的效價為1∶8000。

2．6 討論

為了從禾谷鐮刀菌的固體發酵產物中得到純化的DON，應用高速逆流色譜儀對粗提物中的DON進行分離，通過預實驗，嘗試了多種流動相及固定相組合，比較兩相的分離常數，最終確定高速逆流色譜采用乙酸乙酯－水系統。

圖4 BSA（a）和DON－BSA（b）的 MALDI－TOF－MS圖譜Fig．4 The MALDI－TOF－MS patterns of BSA（a）and DON－BSA（b）

表1 抗DON多克隆抗體的效價Tab．1 The titer of DON polyclonal antibody

相對于Witt等［13］采用的硅膠色譜及薄層層析方法分離DON的研究結果，本研究具有明顯的優勢。首先，高速逆流色譜法操作較簡單、快速、節省溶劑，且可以大量制備，成本低；其次，高效液相色譜法的靈敏度和效率方面明顯好于薄層層析法，樣品回收率也高，損耗??；通過高速逆流色譜進行分離后，可以得到濃縮的含有目標化合物的餾分，同時減少了樣品量，有助于提高后續高效液相色譜純化的效率和效果。將兩種色譜法相結合可以快速分離獲得高純度DON。為此類毒素的相關研究提供了參考，具有較好的實際應用價值。

對于含不同基團的小分子，研究者所采用的人工抗原合成方法各有不同。本研究引入DMAP催化法對DON的羥基進行隨機乙?；?，合成含羧基較多的半抗原，再與BSA和OVA進行偶聯，基質輔助激光解吸附電離串聯飛行時間質譜鑒定表明人工抗原制備成功，并通過免疫動物后，獲得了較高效價的抗體。其中一只小鼠的多克隆抗體效價達到1∶32 000，高于以往報道的DON多克隆抗體的效價。

3 結論

利用高速逆流色譜法結合高效液相色譜法從禾谷鐮刀菌固體發酵產物中分離純化DON，首先以高速逆流色譜在乙酸乙酯－水（1∶1，體積比）為兩相溶劑系統、溫度為25℃、主機轉速為890r·min－1、流速為1．0mL·min－1、檢測波長為254nm的條件下進行分離，再采用高效液相色譜進一步分離純化，從300g大米發酵培養物中得到了8mg DON，純度為97．7%；將純化的DON用于DON人工抗原制備，基質輔助激光解吸附電離串聯飛行時間質譜分析表明，人工抗原制備成功；免疫動物后，研制出了高效價的多克隆抗體。本研究建立的色譜方法操作簡單、分離效果較好，純化的DON可以用于抗體的制備。

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