超分子組裝：設計與制備熒光傳感器的新途徑

賈 蘭，劉曉華，馬彥龍，朱晶心

（太原理工大學材料科學與工程學院，山西 太原030024）

熒光傳感器因其靈敏度高、不損壞樣品、使用方便，在檢測中的應用越來越廣泛。一個真正具有實用價值的熒光傳感器可簡單地分為3個部分［1］：（1）外來物種的識別部分（Receptor）；（2）熒光報告部分（Fluorescence reporter）；（3）連接部分（Spacer）。

熒光報告部分直接影響著檢測的靈敏度，識別部分則與檢測的選擇性息息相關，而連接部分對報告部分與識別部分在空間上的分布也會影響到檢測結果。超分子組裝與傳統有機合成構建熒光傳感器最大的區別在于連接部分不同［1］。傳統的化學有機合成構建的傳感體系，報告部分與識別部分直接相連或通過一定的鏈段連接起來，本質上是共價連接的方式。鑒于其連接部分本質上的剛性，為了提高選擇性而對結合位點進行修飾可能會影響到熒光報告基團的發光性能，因此很難對體系進行進一步的升級和優化。而通過非共價作用連接報告部分與識別部分即以超分子組裝取代有機合成，可以確保識別部分與報告部分空間上的接近從而有利于電荷／能量的傳遞。

與共價連接的方式相比，超分子組裝的方式可以避免共價連接靈活性不足的缺點，將熒光報告部分和識別部分作為亞單元或模塊分別進行設計和合成，建立模塊化的識別部分庫和報告部分庫，然后根據待測物的特點選擇識別部分與報告部分，將它們組裝起來，從而可以篩選出最適合特定檢測物的組合，這種方式也被稱為 “從部分到整體”或“自底向上（Bottom－up）［2］”方式。

在超分子化學中，通過選擇組裝單元種類以及調整濃度或比例可以方便地實現體系的制備與優化過程，而且組裝過程中往往會產生新的結構和功能，從而產生新的潛在應用。通過不同分子之間的組裝可以獲得各種復雜的、功能集成的新型組裝體，超分子組裝已成為設計與制備熒光傳感器的新途徑。

1 基于超分子組裝體的熒光檢測模式

按照組裝體在熒光檢測過程中發生的結構變化，可簡單分為以下3種檢測模式：

1．1 基于競爭反應的指示劑取代檢測

該檢測模式中，熒光報告部分（指示劑）與識別部分（受體）先通過非共價作用形成組裝體系，待測物加入后發生動態的取代反應，待測物將熒光報告部分置換出來，引起熒光信號的變化，這種傳感模式被稱為基于競爭反應的傳感聚集體或指示劑取代檢測（Indicator displacement assay，IDA），如圖1所示［3］。指示劑與受體結合時的光學性質與其在媒介中的游離狀態有所不同，并且受體與待測物和指示劑都有結合作用，但結合能力不同，因而尋找合適的指示劑與受體是該檢測模式的關鍵所在。

這種檢測模式最早的報道見于乙酰膽堿熒光檢測體系［4，5］。Anslyn課題組依據競爭免疫測試中基于抗原的生物傳感模式發展衍生出IDA概念，并應用其原理開發出大量的光學傳感器并首先用于檢測水溶液中的檸檬酸鹽［6］。

圖1 指示劑取代檢測示意圖Fig．1 Schematic of the indicator displacement assay

此后，研究人員陸續實現了許多有機物及無機物的檢測，如磷酸鹽、碳酸鹽、糖類以及手性氨基醇等。此外，IDA的應用中還衍生出一類金屬離子絡合型受體，指示劑可與金屬中心以及受體同時產生配位作用，最常見的是Zn（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）配體，其它金屬構成的配合物用于檢測的報道也很多。

IDA也可應用于其它體系，如熒光基團與金納米粒子的組裝體系。Chen等［7］報道了一種熒光染料尼羅紅吸附在金納米粒子表面檢測巰基分子的方法。在pH值4．0條件下，尼羅紅非共價吸附在金納米粒子表面形成組裝體，熒光通過能量轉移被有效猝滅。加入巰基分子以后，巰基分子將尼羅紅取代，熒光逐漸恢復，可以用于檢測巰基乙胺和同型半胱氨酸，檢測極限達到10nmol·L－1。利用相似的策略，研究人員將熒光共軛聚合物穩定的金納米粒子［8］、近紅外染料分子吸附在金納米粒子表面［9］以及將兩親性聚合物吸附在金納米粒子表面檢測巰基分子［10］，都有很好的檢測靈敏度和選擇性。此外，該策略也可用于檢測蛋白、離子等。

受到指示劑替代檢測的啟發，Dsouza等［11］從主客體識別角度發展出一種新型的超分子串聯酶測定方法（Supramolecular tandem enzyme assays）。該方法可以看作是指示劑取代的一種時間分辨版本，因為競爭試劑不是直接加入，而是隨酶催化反應產生的，其濃度隨時間動態變化。該方法是基于熒光染料與酶催化底物和產物對大環主體如杯芳烴或葫蘆脲的競爭結合，包括兩種檢測類型：如產物與大環主體的結合力高于熒光染料與底物，則在催化過程中，底物的轉化使產物進入大環主體，而熒光染料被競爭出來，這種類型被稱為產物選擇性超分子串聯檢測；如底物與大環主體的結合力高于熒光染料和產物，則催化過程中，底物的轉化使熒光染料進入大環主體，這種類型被稱為底物選擇性超分子串聯檢測。每一種檢測類型都有熒光開和熒光關兩種實現方式。目前這種方法可以檢測的酶種類包括氧化酶（EC1）、轉移酶（EC2）、水解酶（EC3）、裂解酶（EC4），也可用于檢測與酶相關的底物、產物或輔因子。

1．2 基于超分子組裝體解組裝的熒光檢測

該檢測模式中，熒光報告部分與識別部分通過非共價作用組裝，待測物加入后誘導組裝體解組裝，產生熒光信號的改變以實現檢測。一般通過兩種方式實現：待測物將識別部分結合走或待測物誘導識別部分水解，前者適用于檢測生物分子之間的特異性相互作用，后者則主要用于檢測具有水解作用的酶。報告部分多采用熒光共軛聚電解質（CP）或聚集誘導發光（AIE）分子。

生物素－親和素（Biotin－Avidin）之間的相互作用是蛋白質結合最常用的類型之一。Chen等［12］在陰離子共軛聚電解質中加入微量含有Biotin的帶正電猝滅劑，靜電組裝后熒光被猝滅。加入Avidin后，猝滅劑被結合走，熒光恢復，可用于檢測兩種蛋白的相互作用。通過這種方式也可以檢測其它分子間特異性的相互作用，如硼酸衍生物與糖類、肝素與魚精蛋白等。

Wang等［13］報道了基于共軛聚電解質的組裝體用于檢測乙酰膽堿酯酶的方法。陰離子共軛聚電解質與帶正電荷的底物乙酰膽堿通過靜電作用組裝，修飾了猝滅劑的底物使熒光猝滅。加入酶后，底物被水解，猝滅劑基團帶負電，與共軛聚電解質靜電排斥，組裝體解組裝，因而熒光恢復，這一過程可用于檢測酶及其抑制劑。利用對酶底物修飾猝滅劑的策略或酶的底物和產物與共軛聚電解質不同的結合效應，還可檢測核酸酶、磷脂酶C以及蛋白酶。

2001年，唐本忠等偶然發現了聚集誘導發光（AIE）現象，AIE分子作為一種新型的熒光染料開始被研究和應用。Zhang等［14］報道了一種AIE分子檢測DNA以及核酸酶的方法。在季銨化硅雜環戊二烯（Silole）中加入單鏈DNA，通過靜電作用構建組裝體，熒光發射增強，增強的程度與DNA鏈長度相關。加入核酸酶將DNA鏈剪切成寡聚核苷酸，靜電作用減弱，組裝體解體，聚集效應減弱，AIE分子熒光發射強度降低。這一過程可用于檢測核酸酶以及篩選抑制劑。此外，AIE探針也可以利用酶水解前后產物和底物與AIE分子不同的結合效應，用于檢測水解酶活性，如乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、胰蛋白酶等。

1．3 基于構象變化效應的熒光檢測

有些待測物加入到超分子體系中，不會使組裝體解組裝，而是使識別部分的構象發生變化，選擇對構象敏感的報告部分，就可以產生熒光信號的改變。比較常見的對構象敏感的報告部分有熒光共軛聚合物中的聚噻吩類或AIE分子，而構象轉變多是由于核酸適配體與底物結合引起的。

聚噻吩的光學性能與它的共軛主鏈的構象相關［15］，可以用于檢測與聚噻吩結合引起構象轉變的轉化過程或物質。常見的轉化過程有DNA雙鏈雜交、DNA構象從G－四聯體到雙螺旋的轉變等，常見的檢測物主要是引起核酸適配體構象變化的物質，如鉀離子、汞離子、凝血酶等。Ho等［16］報道了陽離子聚噻吩無需熒光標記特異性地檢測凝血酶，這是一個非常典型的例子。非特異性的蛋白如BSA存在時，聚噻吩會與核酸適配體DNA鏈靜電結合，形成平面結構，此時熒光較弱，溶液呈紅色；加入凝血酶時，核酸適配體構象發生轉變，形成G－四聯體，阻礙聚噻吩的鏈形成平面結構，導致顏色轉變為橙色，熒光強度增大。該方法的檢測限達到2×10－15mol·L－1，且核酸適配體具有良好的選擇性。隨著核酸適配體技術研究的深入，這一方法的適用范圍將進一步擴大。

AIE分子對構象的轉變也很敏感，因為不同構象的AIE分子聚集程度不同，從而具備不同的發光性能。Tang等［17，18］報道了 AIE分子用于檢測BSA在表面活性劑存在條件下的解折疊過程、DNA構象從G－四聯體到雙螺旋的轉變。Xu等［19］通過汞離子核酸適配體構象改變誘導的AIE熒光強度改變來檢測汞離子。

2 新的設計方向

2．1 識別或報告基團的聯用

超分子組裝最大的優勢在其靈活性，單一的非共價作用或許不能提供足夠的結合力，但可能通過多結合位點以及多種作用力協同作用來達到足夠強的結合力。識別或報告基團的聯用就是多結合位點或作用力協同作用的體現。

2．1．1 熒光報告基團的聯用

熒光報告基團的聯用可以提高檢測的靈敏度，一般通過熒光共振能量轉移（FRET）實現。Feng等［20］將熒光共軛聚合物用于檢測特定序列的DNA，熒光報告基團包括陽離子共軛聚合物、DNA莖環結構末端的熒光標記以及插入雙鏈DNA會產生熒光的溴化乙錠（EB）。開始時，熒光標記的DNA莖環結構與帶正電的熒光共軛聚合物之間通過靜電作用組裝，發生從共軛聚合物到熒光標記的FRET。當加入互補DNA鏈后，莖環結構構象改變，EB插入新形成的雙鏈DNA中，發生兩步的FRET。這種方法可以提高檢測的靈敏度和選擇性，即便只有一個堿基錯配也可以準確地檢測出來。

Vandienst等［21］設計了熒光共軛聚合物、量子點與單鏈DNA上熒光標記的連續兩步FRET來檢測DNA雜化過程。帶正電的熒光共軛聚合物有兩個作用，一方面作為捕光天線來促進第一步FRET中量子點的發射，另一方面提供正電荷表面使DNA鏈與聚合物／量子點復合體靜電組裝，從而發生第二步FRET，為提高檢測靈敏度和選擇性提供了很大的可能。

2．1．2 識別基團的聯用

目前還沒有通過非共價作用實現識別基團聯用的報道，但已有一些基于主客體識別檢測體系中識別基團共價聯用的范例。Arduini等［22］將β－環糊精和杯［4］芳烴經o－和p－二甲苯基橋聯，發現同單一的環糊精主體相比，這種傳感器表現出對某些客體分子更好的識別能力，如其與水中苯胺基萘磺酸和對甲苯胺基萘磺酸的結合常數增大了400倍。這是因為，杯［4］芳烴的引入擴展了傳感器的分子識別范圍，增強了其與客體分子的疏水相互作用，因此適用范圍更加廣泛。但主體之間也不一定都表現出協同作用，熒光基團與受體空腔形成包結配合物的程度會影響傳感器的傳感能力，熒光基團選擇不恰當時，這種多主體熒光傳感器的優勢就無法體現［23］。

將環糊精二聚體、三聚體甚至多聚體作為熒光傳感器的識別部分也得到了研究，環糊精空腔間協同作用的存在使其可以識別一些大分子。Miranda等［24］首先制備了環糊精三聚體，再在每兩個環糊精之間的連接臂上修飾熒光基團丹酰，制成了多主體熒光傳感器。在該體系中，同時存在3個結合位點和1個相對較大的疏水區域，保證了對客體分子的高選擇性和高靈敏度識別。此外，也有研究將冠醚與杯芳烴橋連作為熒光傳感器的識別部分用于檢測離子，這可能成為超分子熒光傳感器研究的新方向。

2．2 構建陣列實現多組分檢測

前面介紹的檢測方法都是遵循特定的“鎖鑰”原理，識別過程是通過特異性作用發生的。但在很多情況下，對于復雜的待測體系如生物體液、氣味性分子等，難以實現一一對應的特異性識別。陣列方法的優越性在于可以實現復雜體系中多種組分的同時檢測。超分子組裝的方式容易實現體系的制備與優化，構建陣列也比合成的方法更加簡單易行。

基于這種思想，Rotello發展出“化學鼻”的檢測陣列［25］，其設計的中心思想在于通過超分子組裝的方式構建陣列以及通過線性判別分析進行區分識別。Rotello等［26］制備了6種不同功能團修飾的帶正電荷的金納米粒子，金納米粒子與陰離子熒光共軛聚電解質靜電組裝構建陣列用于檢測蛋白。在組裝體系中加入多種蛋白，不同尺寸和電荷的蛋白對組裝體系產生不同的熒光響應，構建陣列可以區分納摩爾級別的蛋白，在55種蛋白中可以區分52種，準確率為94．2%。以綠色熒光蛋白代替熒光共軛聚合物［27］，可減少熒光基團與血清中不同蛋白的非特異性作用，并避免了聚集引起的自猝滅以及激基締合物的形成，檢測效率更高。這種方法被進一步用于區分細菌以及細胞，如區分同基因型的正常細胞、癌細胞以及轉移癌細胞等，有望用于癌癥檢測。

熒光團取代的方式使靈敏度受限于報告基團本身的光學性能。為了克服這一限制，Grandini等［28］運用了酶放大陣列檢測（EAAS）來進一步提高靈敏度。這種EAAS結合化學鼻檢測的多樣性，可以測定一系列的生物相關蛋白，在緩沖溶液和稀釋尿液中的檢測極限達到1nmol·L－1。

2．3 傳感器器件化

熒光傳感器的另一個研究趨勢就是將分析方法器件化，這樣可以實現傳感器的重復使用，減少污染，方便檢測。一般超分子組裝是在溶液中應用，在界面或表面實現超分子組裝就向器件化邁進了一步。早在1999年Tecilla和Tonellato課題組就提出“模板輔助自組裝傳感器（Template－assisted self－organized chemosensor）”方式［29］，借助于模板的作用，不需要或只需要簡單的合成步驟，就可以將批量的報告基團和識別基團在模板上組裝，并篩選出對特定應用最適合的組合。迄今為止已經發展出多種模板，包括膠束聚集體、單分子薄膜、玻璃以及納米粒子［2］。此外，研究者將β－環糊精和芘同時固定化到石英玻璃表面的殼聚糖薄膜上［30］，得到了對硝基甲烷特異響應的新型薄膜材料，這種材料可以長期儲存并反復使用。

Crego－Calama課題組在玻璃表面構建自組裝單層膜，通過微打印技術來沉積不同的熒光團以及小分子組合作為檢測多種離子檢測的平臺［31］。該研究結合了微打印與陣列檢測的優勢，可用于多種檢測體系，對于分析器件的微型化也有著重要的意義。研究者還進行了在納米粒子表面通過超分子組裝構建傳感器的研究，這種策略將納米技術、智能材料以及超分子化學結合起來，為傳感器的設計與檢測模式帶來新的可能。

3 結語

超分子組裝減少了有機合成的步驟，為快速構建和優化熒光傳感器提供了新的途徑。多樣的組裝單元與組裝方式也利于獲得各種復雜的、功能集成的新型組裝體。超分子組裝在生物檢測方面的應用涵蓋了離子、小分子、蛋白、各種酶甚至細胞、細菌等，在食品工業、環境監測、臨床診斷等多個領域中都有著巨大的應用潛力。

但是，超分子組裝在生物檢測中的應用研究逐漸深入的同時，與實際應用目標相結合的熒光檢測技術依然存在一定的局限性。對于檢測器件的設計、制備以及系統評價方面的研究仍然不多。實現界面或表面可控超分子組裝，開發以應用為目的的快速靈敏、可反復使用、高通量檢測的檢測器件是實現超分子組裝在熒光檢測方面更為廣泛應用的發展方向。

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