一株高效石油降解菌的紫外微波復合誘變改良

張云波,劉海濤,趙雅坤

(中國石油大學(華東)環境與安全工程系,山東青島266580)

一株高效石油降解菌的紫外微波復合誘變改良

張云波,劉海濤,趙雅坤

(中國石油大學(華東)環境與安全工程系,山東青島266580)

運用紫外、微波復合誘變技術,對高效石油降解菌KO5-2-11進行改良,根據致死率曲線,選擇紫外誘變時間為100 s、微波誘變時間為45 s。經過連續4次紫外誘變,得到紫外誘變改良菌UV2;將其作為微波誘變的出發菌株,經2次微波誘變,最終得到遺傳穩定的高效耐高溫石油降解菌UM2-6。比較KO5-2-11和UM2-6的溫度耐受性發現,UM2-6的耐高溫性能良好,在55℃的高溫下仍具有27.42%的石油降解率,其最高石油降解率出現在45℃,達到48.72%,較KO5-2-11提高20.81%,改良效果明顯。

石油降解菌;耐高溫;紫外微波復合誘變;改良

新疆地區夏季高溫干旱,石油污染土壤日益嚴重,迫切需要高效的耐高溫石油降解菌進行生物修復。作者運用高效的紫外、微波復合誘變技術對現有菌種進行改良,提高其溫度耐受性和最適生長溫度,得到在高溫環境下石油降解效率較高的菌株,擬為高溫干旱地區的石油污染土壤修復提供技術支持。

1 實驗

1.1 材料與儀器

石油:采自新疆百口泉井區,密度0.792 g· cm-3,粘度1923.14 mPa·s(50℃),飽和烴含量71.17%,芳香分含量18.42%,膠質含量9.89%,瀝青質含量0.52%。

OIL-510型全自動紅外分光測油儀,北京華夏科創儀器技術有限公司;HZQ-QX型全溫振蕩器,哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;BCM-1000型生物凈化臺。

1.2 菌種與培養基

菌種:從克拉瑪依石油污染土壤中篩選得到高效石油降解菌KO5-2-11,紅球菌屬,最適生長溫度為30℃,最高耐受溫度為50℃。

無機鹽培養基(MSM)[1]:Na2HPO40.6 g, KH2PO40.2 g,Na NO34.0 g,MgSO40.3 g,CaCl20.01 g,FeSO40.01 g,酵母粉0.5 g,蒸餾水1000 mL, p H值7.0。

LB培養基(g·L-1):胰蛋白胨10.0,酵母浸出膏5.0,NaCl 5.0,瓊脂20.0(固體培養基用),p H值7.2～7.4。

1.3 方法

采用平板菌落計數法,統計誘變前后菌落數,計算致死率,繪制致死率曲線,據其選擇合適的誘變時間。先將KO5-2-11菌懸液進行紫外誘變,再將石油降解效果最好的紫外誘變菌株作為出發菌株進行微波誘變,篩選得到復合誘變的改良菌。

1.4 石油降解率的測定

初始石油含量據培養基添加石油前后的質量差獲得。培養后培養基中的石油含量采用全自動紅外分光測油儀測定。測定參照GB/T16488-1996《水質、石油類和動植物油的測定-紅外光度法》,并稍做改進,采用循環水式真空泵將萃取液抽入抽濾瓶中。為了保證脫水效果,將無水Na2SO4的厚度加大為15 mm[2]。

2 結果與討論

2.1 紫外誘變改良

2.1.1 紫外誘變劑量的確定

向直徑9 cm的培養皿中加入濃度為1×108cfu ·m L-1的菌懸液5 m L,打開紫外燈,預熱20～30 min,在距離為80 cm、功率為15 W的2根紫外燈下照射后,吸取0.1 m L涂布于含油固體平板上,在50℃生化培養箱中避光培養48 h,統計誘變前后的菌落數[3,4]。菌株的紫外誘變致死率如圖1所示。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 The lethal rate curve for UV mutagenesis

研究發現,正向突變多發生在低劑量的誘變中,因此,在誘變研究中,適宜使用致死率為70%～80%的相對劑量[5]。由圖1可知,隨著紫外誘變時間的延長,石油降解菌的致死率急劇上升;當紫外誘變超過一定時間后,致死率上升緩慢直至幾乎不變。紫外誘變時間100 s的致死率為73.86%,介于最適致死率70%～80%之間,因此選擇紫外誘變時間為100 s。

2.1.2 紫外誘變菌種的篩選結果

實驗發現,經過連續4次紫外誘變以后,正突變率趨于穩定,因此,選擇第4次紫外誘變時進行篩選。初篩得到52株菌,挑選生長旺盛的27個菌落進行轉接,連續3次后,得到6株菌(編號UV1～UV6)[6],將它們移入100 m L石油含量為1%的無菌MSM培養基中,在160 r·min-1、50℃下暗室培養7 d,其對原油的降解現象及降解率如表1所示。

表1 紫外誘變菌株對石油的降解情況及降解率Tab.1 The phenomenon and petroleum degradation rate for UV mutagenesis strains

由表1可知,6株菌中,UV2的降解效果明顯好于其它5株菌,1%石油的降解率達到38.63%。因此,選擇UV2作為微波誘變的出發菌株。

2.2 微波誘變改良

2.2.1 微波誘變劑量的確定

將5 m L UV2菌懸液加入到10 m L試管中,用2450 MHz、800 W微波誘變處理,每隔5 s,置于冰上冷卻至室溫,如此交替進行,誘變結束后,吸取0.1 m L涂布于含油固體平板上,然后在50℃生化培養箱中避光培養48 h,統計誘變前后的菌落數[7,8]。菌株UV2的微波誘變致死率如圖2所示。

圖2 微波誘變致死率曲線Fig.2 The lethal rate curve for microwave mutagenesis

由圖2可知,隨著微波誘變時間的延長,石油降解菌的致死率急劇上升;當微波誘變超過一定時間后,致死率上升緩慢直至幾乎不變。微波誘變40 s和50 s的致死率分別為69.39%和81.45%,因微波誘變劑量范圍應使誘變致死率在70%～80%之間,因此選擇微波誘變時間為45 s。

2.2.2 微波誘變菌種的篩選結果

實驗發現,經過連續2次微波誘變以后,正突變率達到穩定,因此,選擇第2次微波誘變時進行篩選。初篩得到47株菌,挑選生長旺盛的21個菌落進行轉接,連續3次后,得到9株菌(編號UM2-1～UM2-9),將它們移入100 m L石油含量為1%的無菌MSM培養基中,在160 r·min-1、50℃下暗室培養7 d,其對原油的降解現象及降解率[9]如表2所示。

表2 微波誘變菌株對石油的降解情況及降解率Tab.2 The phenomenon and petroleum degradation rate for microwave mutagenesis strains

由表2可知,9株菌中,UM2-6的降解效果顯著高于其它8株菌,1%石油的降解率達到44.43%。將UM2-6轉接4次考察其遺傳穩定性,培養7 d后石油的降解率穩定在42.24%～44.79%之間,遺傳穩定。因此,選擇UM2-6作為紫外、微波復合誘變的改良菌。

2.3 高效耐石油降解菌UM2-6的溫度耐受性

將KO5-2-11和UM2-6分別移入100 m L石油含量為1%的無菌MSM培養基中,在160 r·min-1條件下,分別于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃培養7 d,測定石油降解率,比較改良前后對溫度的耐受性[10],結果見圖3。

圖3 KO5-2-11和UM2-6的溫度耐受性比較Fig.3 Comparison of temperature tolerance between KO5-2-11 and UM2-6

由圖3可知,UM2-6在45℃時石油降解率達到最高,為48.72%,明顯高于KO5-2-11的27.91%;在50℃時,KO5-2-11的石油降解率僅有14.29%,而UM2-6石油降解率為43.14%,仍具有明顯的石油降解能力;在55℃時,KO5-2-11的石油降解率低至8.36%,基本喪失了石油降解能力,而UM2-6仍有27.42%的石油降解率,耐高溫性能良好。

3 結論

(1)以實驗室現有的高效石油降解菌KO5-2-11為改良出發菌種,根據致死率曲線,確定紫外誘變時間為100 s、微波誘變時間為45 s,先后進行4次紫外和2次微波復合誘變,最終改良得到遺傳穩定的耐高溫石油降解菌UM2-6。

(2)對KO5-2-11和UM2-6進行溫度耐受性比較,結果表明,UM2-6的耐高溫性能良好,在55℃的高溫下,仍具有27.42%的石油降解率,其最高石油降解率出現在45℃,達到48.72%,較KO5-2-11提高20.81%,改良效果明顯。

[1] 李政,趙朝成,張云波,等.耐熱石油降解混合菌群的降解性能研究[J].化學與生物工程,2011,28(12):37-42.

[2] 劉其友,宗明月,張云波.耐熱石油烴降解混合菌的篩選及其群落結構分析[J].生態環境學報,2012,21(8):1468-1472.

[3] 王靖然.產表面活性劑采油菌株的誘變育種[D].哈爾濱:黑龍江大學,2009.

[4] Zinjarde S S,Pant A A.Hydrocarbon degraders from tropic marine environments[J].Marine Pollution Bulletin,2002,44(3): 118-121.

[5] 周群英,王士芬.環境工程微生物學(第三版)[M].北京:高等教育出版社,2008:121-126.

[6] 高興強,黃運紅,戴菲.熱效應在微生物誘變育種中的應用[J].微生物學通報,2009,36(10):1592-1595.

[7] 陳力力,魯迎新.微波誘變選育井岡霉素高產菌[J].生物技術, 2003,13(5):14-15.

[8] Kirsschvink J L.Microwave absorption by magnetite:A possible mechanism for coupling nonthermal levels of radiation to biological systems[J].Bioelectromagnetics,1996,17(3):187-194.

[9] 劉海臣,冉淦僑,張興,等.酒糟中超高溫耐高酒精度酵母菌株的選育[J].釀酒科技,2007,(5):28-31.

[10] 唐受印,戴友芝,汪大翠,等.廢水處理工程[M].北京:化學工業出版社,2004:227-229.

UV-Microwave Mutagenesis Improvement on An Efficient Petroleum Degradation Strain

ZHANG Yun-bo,LIU Hai-tao,ZHAO Ya-kun
(Department of Environmental and Safety Engineering, China University of Petroleum,Qingdao 266580,China)

UV-Microwave mutagenesis technique was used to improve the efficient petroleum degradation strain KO5-2-11.Based on the lethal rate curves,the mutagenesis time of UV and microwave were determined as 100 s and 45 s,respectively.After the accumulation of UV mutagenesis for four times,the improved strain UV2 was achieved,which could be used as the original strain for microwave mutagenesis.After twice microwave mutagenesis,an efficient petroleum degradation strain UM2-6 with high genetic stability and thermostability was finally obtained.The thermostablity comparison between KO5-2-11 and UM2-6 showed that under the high temperature of 55℃,UM2-6 still had a petroleum degradation rate up to 27.42%with high heat tolerance,and the maximum petroleum degradation rate was 48.72%at 45℃,20.81%higher than that of KO5-2-11,showing obvious effect of improvement.

petroleum degradation strain;thermostable;UV-microwave mutagenesis;improvement

X 53

A

1672-5425(2013)07-0071-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.019

中央高?；究蒲袠I務費專項資金資助項目(11CX06048A)

2013-04-16

張云波(1965-),女,四川德陽人,副教授,主要從事生物技術在環境保護中的應用研究。