腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的可溶性表達及純化條件的優化

趙 芳，劉 葉，呂 靜，代廣知，譚樹華

（中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京210009）

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF－Related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）或稱凋亡素2配體（Apoptosis ligand，APO－2L）是腫瘤壞死因子（TNF）超家族的新成員。人TRAIL分子由281個氨基酸組成，為Ⅱ型跨膜蛋白。TRAIL能夠選擇性地誘導多種腫瘤細胞凋亡，但對多數正常細胞沒有殺傷活性［1－4］，因此在腫瘤免疫治療中有很廣闊的應用前景。TRAIL胞外區部分形成的可溶性多肽（sTRAIL）已具有全長TRAIL的活性，也能與TRAIL的天然受體特異性地結合，使信號傳導途徑被激活，最終導致細胞凋亡［5，6］。

作者采用PCR方法，以人胎盤cDNA為模板，特異性地擴增出編碼TRAIL的可溶性片段（114～281個氨基酸）即sTRAIL的基因，然后成功構建sTRAIL的原核表達載體，并在大腸桿菌中得到高效表達，優化了sTRAIL的純化條件，獲得高純度的sTRAIL，并測定了其生物學活性。

1 實驗

1．1 質粒、菌種和培養基

克隆載體pMD19－T，Takara公司；表達載體pTASH、大腸桿菌JM109均為自行保存。

LB培養基：蛋白胨1%，酵母提取物0．5%，氯化鈉1%，氨芐青霉素100mg·L－1，pH值7．0。

發酵培養基：蛋白胨1%，酵母提取物0．5%，谷氨酸鈉4%，麥芽汁1%，磷酸二氫鉀0．671%，磷酸氫二鈉0．757%，氨芐青霉素100mg·L－1，pH值6．5。

1．2 工具酶及試劑

Taq酶、限制性內切酶Eco RⅠ和 Hind Ⅲ、T4DNA連接酶，Takara公司；人胎盤cDNA，康為世紀公司；dNTP，南京生興公司；兔抗人TRAIL蛋白的抗體，巴傲得生物公司；HRP標記的羊抗兔IgG，BOSTER 公 司；SP－Sepharose FF、Q－Sepharose FF，GE公司。

實驗用試劑均為國產分析純。

1．3 方法

1．3．1 sTRAIL基因的克隆

1．3．1．1 引物設計與合成

參考已報道的sTRAIL的cDNA序列［6］，根據表達載體pTASH多克隆位點特點設計一對引物（由上海捷瑞公司合成），引物序列如下（下劃線部分為引入的Eco RⅠ、HindⅢ酶切位點）：

P1：5′－CCGAATTCATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAG－3′

P2：5′－GTAATCAAGCTTAGCCAACTAAAA－AGGCCCCGAAAAAACTG－3′

1．3．1．2 PCR擴增sTRAIL基因

以人胎盤cDNA作為PCR反應的模板，以引物P1、P2PCR擴增sTRAIL基因。PCR反應條件為：94℃5min；94℃30s，50℃ 30s，72 ℃90s，30個循環；72℃10min。取純化的TRAIL PCR產物與pMD19－T載體連接，通過Amp抗性篩選重組質粒，經PCR鑒定為陽性，提取陽性菌落的質粒DNA，用酶切鑒定，陽性克隆質粒送上海美吉生物科技有限公司測序。

1．3．2 sTRAIL表達載體和工程菌的構建

用Eco RⅠ和HindⅢ 雙酶切pMD19－TRAIL和原核表達載體pTASH，回收目的片段，用T4DNA連接酶連接。連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109，在含Amp的LB培養板上挑取單菌落，經PCR鑒定，選取PCR陽性克隆，于LB培養液中37℃下搖床培養過夜，提取質粒，用Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。挑取陽性克隆進行測序鑒定以驗證表達載體序列。最終篩選出目的菌株。

1．3．3 sTRAIL的表達

取工程菌單菌落接種于含100mg·L－1Amp的LB培養液中，37℃下振蕩培養過夜；次日按2%接種量接種于含 100mg·L－1Amp、100μmol·L－1ZnSO4的發酵培養液中，37℃下振蕩培養24h；取出培養物，離心收集菌體，超聲破碎后取細胞裂解產物，離心，收集上清和沉淀，用SDS－PAGE分析表達產物及表達形式。

1．3．4 sTRAIL的分離純化

1．3．4．1 SP－Sepharose FF和 Q－Sepharose FF結合純化

收集表達后菌體，按10mL·g－1（濕重）加入到緩沖溶液［20mmol·L－1Tris－HCl（pH 值8．5），1mmol·L－1EDTA，500mmol·L－1NaCl］中，超聲破碎細菌，13 000r·min－1離心30min，取上清。以30BV透析外液（20mmol·L－1Tris－HCl，100μmol·L－1ZnSO4，pH值7．6）透析24h，中間換1次透析外液，過SP－Sepharose FF柱，NaCl連續梯度洗脫，收集0．3 mol·L－1NaCl洗脫峰。再以30BV的透析外液（20 mmol·L－1Tris－HCl，100μmol·L－1ZnSO4，pH 值9．0）透析24h，中間換1次透析外液，過 Q－Sepharose FF柱，NaCl連續梯度洗脫，收集0．2mol·L－1NaCl洗脫峰，用純水透析，凍干。

1．3．4．2 SP－Sepharose FF和RP－HPLC結合純化

首先按1．3．4．1的方法過 SP－Sepharose FF柱，收集0．3mol·L－1NaCl洗脫峰；再使用Bio－rad公司的DuoFlow制備型液相色譜系統［色譜條件：色譜柱為 Kromasil 5－C18色譜柱（10mm×250mm），流動相A相為0．1%TFA／H2O、B相為0．1%TFA／CNCH3，流速1mL·min－1，梯度為：20min，15%～40%B；40min，40%～65%B；5min，65%～100%B］，收集53%B相洗脫峰，凍干。

1．3．5 sTRAIL蛋白純品的鑒定

采用SDS－PAGE法分析sTRAIL蛋白純品的純度、Western blot法分析其免疫原性、BCA法測定其蛋白含量，各實驗均按常規進行。Western blot一抗為兔抗人TRAIL蛋白多克隆抗體（效價為1∶500），二抗為HRP標記的羊抗兔IgG（效價為1∶5000），檢測用ECLTMKit（增強化學發光試劑盒）。

1．3．6 sTRAIL生物學活性測定

取對數生長期的HepG2細胞以每孔5×103個接種于96孔板，培養24h后加入sTRAIL純化蛋白至濃度（nmol·L－1）分別為5．15、10．31、20．62、41．24、51．55、103．09，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養72h，顯微鏡下觀察MTT法染色分析結果。細胞抑制率依下式計算［3］：

式中：As、Ac分別為樣品和對照在570nm下的吸光度值。

2 結果與討論

2．1 sTRAIL基因的克隆

以人胎盤cDNA為模板，以相應引物進行PCR擴增得到約500bp的特異片段（圖1）。片段大小與預期目的基因大小相符。回收此擴增片段，克隆入pMD19－T載體中進行測序，測序結果與所報道的sTRAIL序列一致，在序列兩端可見引入的Eco RⅠ和HindⅢ位點。將陽性克隆質粒DNA命名為pMD19－TRAIL。

圖1 sTRAIL的PCR擴增Fig．1 PCR Amplification of sTRAIL

2．2 sTRAIL表達載體的構建、鑒定

用Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切pMD19－TRAIL和表達載體pTASH，然后亞克隆，構建重組質粒pTA－sTRAIL，進行PCR鑒定（圖2a）。PCR陽性克隆用Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切，結果符合預期（圖2b）。DNA測序結果與所報道的sTRAIL序列一致，證明sTRAIL表達載體構建成功。

圖2 重組質粒pTA－sTRAIL的鑒定Fig．2 Identification of recombinant pTA－sTRAIL

2．3 sTRAIL的表達與純化

對sTRAIL表達產物進行SDS－PAGE電泳分析，觀察到分子量與理論值（約19．6kD）相符的明顯表達帶（圖3）。薄層掃描顯示sTRAIL高效可溶表達，其表達量占菌體總蛋白的20%。破碎上清經SP－Sepharose FF柱純化，目的蛋白得到初步純化，純度達76%；再經過 Q－Sepharose FF柱純化，純度達93%；而再經過RP－HPLC純化，純度可達98%以上（圖4），即每升細菌培養液可得到15mg純化的sTRAIL。

圖3 sTRAIL表達產物的SDS－PAGE分析Fig．3 SDS－PAGE Analysis of expression of sTRAIL

2．4 sTRAIL蛋白鑒定

將sTRAIL蛋白純品進行SDS－PAGE分析后電轉移至硝酸纖維素膜上，利用兔抗人TRAIL蛋白多克隆抗體作Western印記。結果顯示sTRAIL蛋白純品能與兔抗人TRAIL蛋白多克隆抗體發生特異性反應（圖5）。

2．5 sTRAIL的生物學活性

為了檢測純化后sTRAIL蛋白的生物學活性，在HepG2細胞株中加入不同濃度的純化sTRAIL，MTT結果顯示，sTRAIL對HepG2細胞生長具有明顯抑制作用并存在劑量依賴，IC50為48．82nmol·L－1（圖6）。

2．6 討論

目前，腫瘤治療中一直應用具有細胞毒性的化學藥物，這些藥物在治療腫瘤的同時也導致了機體的損傷和藥物的抗性，因此希望利用基因療法解決該問題。

6 MTT檢測sTRAIL對HepG2細胞生長的抑制作用Fig．6 Determination of proliferation inhibition activity of sTRAIL to cell HepG2by MTT method

近年來研究表明，細胞凋亡與腫瘤發生、發展與消退有密切關系，腫瘤被認為是細胞增殖和死亡失衡所致。誘導腫瘤細胞凋亡可能是許多藥物抑制腫瘤生長的機制之一，細胞凋亡成為抗腫瘤藥物的新靶點［7］。其中TNF超家族可與其相應的受體結合而導致細胞凋亡，因而引起人們的廣泛重視。TNF－α和FAS－L是TNF超家族中首先被克隆的兩個分子，能有效地殺死腫瘤細胞，但也能導致正常組織的損傷，如TNF導致嚴重的炎癥反應、FAS引起嚴重的肝損傷，因此難以進入臨床應用。由于TRAIL能選擇性地殺傷腫瘤細胞而對正常組織幾乎無毒副作用，所以TRAIL及其受體一經發現便被認為具有巨大的臨床應用價值，成為人們研究的熱點［8］。

有報道發現膜結合型TRAIL在小鼠中亦可引發肝細胞毒性和肝損傷［9］。因此本研究選擇TRAIL全長的第114～281個氨基酸部分，該部分是現在發現的無毒性、可溶性及生物學活性兼具的片段［10］。

pTASH是本實驗室采用新型大腸桿菌L－門冬酰胺酶Ⅱ（ASPsⅡ）信號序列構建的分泌表達載體［11］，其多克隆位點上游Ptac是來自于Pkk223－3的Tac強啟動子。構建成功的原核表達載體pTASH－sTRAIL在表達sTRAIL過程中無需IPTG誘導，就能高效表達目的蛋白。而且表達的sTRAIL蛋白大部分為可溶性，避免了包涵體蛋白變性、復性所引起的蛋白含量減少和生物學活性的降低。

在純化sTRAIL時，考慮到其高等電點（pI＝8．9）［12］，先過 SP－Sepharose FF 柱，除掉大部分雜蛋白，再過Q－Sepharose FF柱進一步進行純化，得到純度達93%的sTRAIL。考慮到目的蛋白的穩定性，對純化條件進行了優化。選擇RP－HPLC代替Q－Sepharose FF柱，不僅使純化步驟得以簡化、蛋白更穩定，而且能得到純度達98%以上的sTRAIL。

晶體結構的X－衍射分析表明［13］，天然的TRAIL由Zn2＋調節形成同源三聚體，Zn2＋隱蔽在活性中心，證明Zn2＋對維持TRAIL天然構象和其穩定性十分重要，因此在表達和純化過程中都加入一定量ZnSO4以維持表達產物的天然結構和活性，取得了滿意的效果。

3 結論

以人胎盤cDNA為模板，通過PCR技術特異性擴增出約500bp的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體sTRAIL基因。經雙酶切后插入到原核表達載體pTASH的Eco RⅠ和HindⅢ之間，轉化大腸桿菌JM109菌株。宿主菌主要以可溶形式表達sTRAIL，可溶形式sTRAIL蛋白達到60%。破碎上清經過SPSepharose FF和RP－HPLC兩步純化后，純度達98%以上。重組蛋白在體外能明顯誘導腫瘤細胞凋亡。

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