無細胞百日咳脫毒PT抗原超濾工藝研究

黃 鍇，胡慧瓊，楊國友，張 華，唐朝暉，梁淑芳，秦 敏

（1．四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都610041；2．成都生物制品研究所有限責任公司，四川 成都610023）

百日咳是一種嚴重威脅嬰幼兒健康的急性呼吸道傳染病，傳染性強，且人群普遍易感。百日咳的病原體為百日咳桿菌，是引起百日咳的病原苗，會產生百日咳毒素（PT）、絲狀血凝素（FHA）、百日咳桿菌粘著素（Prn）、凝集原（AG）、內毒素、腺苷環(huán)化酶（AC）、纖毛（Fim）、支氣管細胞毒素（TC）等多種具有生物學活性的物質，它們在百日咳桿菌的致病與免疫中發(fā)揮著不同的作用［1］。百日咳桿菌的主要毒力因子為PT，具有多種生物學活性，導致多種多樣的百日咳臨床癥狀［2］。經(jīng)過化學脫毒的PT也是疫苗中唯一沒有爭議的保護性抗原［3］。

目前，國內計劃免疫所用的無細胞百日咳疫苗是由百日咳桿菌的培養(yǎng)物經(jīng)硫酸銨鹽析和密度梯度離心法提取的多組分抗原（含有PT和FHA等有效成分），經(jīng)戊二醛脫毒后超聲勻化制成。PT抗原脫毒后呈紅棕色，有大量的絮狀沉淀，因此，難以用超濾方法去除色素、戊二醛等小分子，而普遍通過透析袋透析，存在大量弊端：需更換大量透析液；透析時間長；需加入防腐劑，對環(huán)境和人體造成危害；透析袋的材質和性能缺乏嚴格的驗證等［4］。隨著無細胞百日咳工藝的發(fā)展，新的純化工藝已經(jīng)能制備出單組分PT抗原；且新的脫毒工藝能有效控制其絮狀沉淀的產生。PT抗原是具有高疏水性的蛋白，容易形成聚集體吸附在超濾膜上［5］，便于使用快捷方便的超濾方式去除小分子，解決了透析袋透析的諸多弊端。

作者在前期無細胞百日咳PT抗原純化、脫毒工藝研究的基礎上，對脫毒后的PT抗原采用不同超濾裝置、不同超濾液以及不同孔徑的超濾膜進行超濾，通過超濾后制品外觀、超濾前后蛋白回收率來確定合適的超濾方式。

1 實驗

1．1 樣品

無細胞百日咳脫毒PT抗原由成都生物制品研究所有限責任公司細菌性疫苗一室提供，該抗原按已經(jīng)確定的PT抗原脫毒方案進行脫毒，通過前期的動物檢定符合要求。

1．2 試劑與儀器

氯化鈉，天津海光藥業(yè)有限公司；磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉，廣東光華化學有限公司；注射用水由細菌性疫苗一室提供。

中空纖維超濾器 Quixstand（膜孔徑：10kD、30 kD；中空纖維柱型號：UFP－10－C－4X2MA、UFP－30－C－4X2MA），GE公司；膜式超濾器FILTRON CENTRAMATETM（膜孔徑：10kD、30kD；膜型號：T－Series Cassette），PALL公司；蠕動泵，Watson－Marlow公司。

1．3 超濾方法

先用超濾液將脫毒PT抗原稀釋3～5倍，超濾濃縮至原體積的1．5倍；再用超濾液進行等體積超濾，進液端壓力不高于0．15MPa，回流端壓力不高于0．05 MPa，恒流泵轉速控制在80～120r·min－1。當脫毒PT抗原超濾至肉眼觀察無色時停止超濾，收集超濾系統(tǒng)中的脫毒PT抗原；最后用400mL超濾液循環(huán)沖洗超濾系統(tǒng)5～10min后濃縮至約100mL，合并收集于脫毒PT抗原中。

1．4 超濾條件篩選

分別采用不同超濾裝置（中空纖維超濾器、膜式超濾器）、不同濃度（0．15mol·L－1、0．5mol·L－1、1 mol·L－1）和不同pH 值（6．6、7．0、7．4、7．8）的超濾液、不同孔徑（10kD、30kD）超濾膜對脫毒PT抗原進行超濾，對超濾后蛋白回收率和物理外觀進行評估，以確定最適宜的超濾條件。

1．5 測定方法

物理外觀通過肉眼觀察進行判斷；蛋白含量根據(jù)《中華人民共和國藥典》三部（2010年版）附錄ⅥB中的Lowry法測定，檢測脫毒前后PT抗原的蛋白含量，用于計算超濾前后的蛋白回收率；戊二醛含量根據(jù)《中華人民共和國藥典》三部（2010年版）附錄Ⅶ測定，用于評估超濾法去除脫毒劑的能力［6］。

2 結果與討論

2．1 不同超濾裝置對超濾的影響

在使用相同的超濾液、相同孔徑的超濾膜、超濾膜面積大致相等的條件下，使用不同類型的超濾裝置對脫毒PT抗原進行超濾，超濾制品外觀及蛋白回收率見表1。

表1 不同超濾裝置對超濾的影響Tab．1 Effect of different ultrafiltration apparatuses on ultrafiltration

由表1可以看出，不管使用哪種超濾液，膜式超濾器相對于中空纖維超濾器，超濾后脫毒PT抗原的物理外觀更好、蛋白回收率更高；在進液端壓力、回流端壓力、恒流泵流速相同，超濾膜面積大致相等的情況下，膜式超濾器出液端的流速明顯高于中空纖維超濾器；此外，膜式超濾器對脫毒PT抗原顏色的吸附也較少。因此，選擇膜式超濾器進行超濾。

2．2 不同類型超濾液對超濾的影響

選擇膜式超濾器，使用不同濃度的NaCl溶液以及pH值為7．8的含不同濃度NaCl的PB緩沖溶液對脫毒PT抗原進行超濾，測定超濾后的蛋白回收率，結果見表2。

由表2可以看出，用0．15mol·L－1的 NaCl溶液、PB緩沖溶液以及含0．15mol·L－1NaCl的PB緩沖溶液超濾都無法去除料液的顏色，無法進行蛋白定量；含NaCl的PB緩沖溶液的蛋白回收率明顯高于相同濃度的NaCl溶液；含0．5mol·L－1和1mol·L－1NaCl的PB緩沖溶液的蛋白回收率無明顯差異。考慮到工藝后期PT抗原吸附對離子濃度的要求，選擇含0．5mol·L－1NaCl的PB緩沖溶液作為超濾液。

2．3 不同pH值的超濾液對超濾的影響

選擇膜式超濾器，使用不同pH值的含0．5mol·L－1NaCl的PB緩沖溶液對脫毒PT抗原進行超濾，測定超濾后的蛋白回收率，結果見表3。

表2 不同類型超濾液對超濾的影響Tab．2 Effect of different types of ultrafiltration solution on ultrafiltration

表3 不同pH值超濾液對超濾的影響Tab．3 Effect of different pH values of ultrafiltration solution on ultrafiltration

由表3可以看出，超濾液的pH值對脫毒PT抗原的蛋白回收率有明顯影響，隨著pH值的增大，蛋白回收率相應升高；pH值為7．8時，蛋白回收率達到最高。因此，選擇含0．5mol·L－1NaCl的PB緩沖溶液的pH值為7．8。

2．4 不同孔徑超濾膜對超濾的影響

無細胞百日咳PT抗原的分子量約80kD［7］，脫毒后抗原會發(fā)生交聯(lián)，分子量相應增加。選擇膜式超濾器、pH 值為7．8的含0．5mol·L－1NaCl的PB緩沖溶液，使用不同孔徑超濾膜對脫毒PT抗原進行超濾，測定超濾后的蛋白回收率，結果見表4。

表4 不同孔徑超濾膜對超濾的影響Tab．4Effect of different pore sizes of ultrafiltration membrane on ultrafiltration

由表4可以看出，30kD超濾膜對脫毒PT抗原的蛋白回收率明顯高于10kD超濾膜。因此，選擇30 kD超濾膜進行超濾。

2．5 脫毒PT抗原超濾檢測結果

選擇30kD膜式超濾器，用pH值為7．8的含0．5 mol·L－1NaCl的PB緩沖溶液對連續(xù)3批脫毒PT抗原進行超濾，結果見表5。

由表5可以看出，脫毒PT抗原超濾后能有效去除色素、脫毒劑等小分子，物理外觀良好，蛋白回收率接近80%。

3 結論

表5 連續(xù)3批超濾檢測結果Tab．5 Determination results of ultrafiltration for continuous three batches

選擇30kD膜式超濾器，用pH值為7．8的含0．5 mol·L－1NaCl的PB緩沖溶液對脫毒PT抗原進行超濾，可以有效地去除色素、脫毒劑等小分子；超濾后的抗原澄清透明無沉淀；戊二醛殘留量也遠遠低于《中華人民共和國藥典》三部要求；超濾后蛋白回收率接近80%，且通過放大超濾規(guī)模或改變超濾膜面積，超濾蛋白回收率可能會進一步提高。

［1］秦力，何長民．百日咳毒素和絲狀血凝素的純制和檢測現(xiàn)況［J］．微生物學免疫學進展，1997，25（1）：87－89．

［2］楊瑜，朱為．百日咳毒素在疫苗中的研究現(xiàn)狀及應用［J］．國際生物制品學雜志，2007，30（4）：156－159．

［3］楊曉明．百日咳疫苗現(xiàn)狀和發(fā)展方向［J］．中國生物制品學雜志，2003，16（2）：128－130．

［4］陳浩軍，王旭宇，蔡清波．無細胞百日咳疫苗抗原精制的新技術［J］．中國生物制品學雜志，2010，23（9）：1032．

［5］吳鐵，閉靜秀，黃永東，等．溶液環(huán)境對百日咳疫苗分離純化的影響［J］．生物工程學報，2008，24（7）：1279－1284．

［6］國家藥典委員會．《中華人民共和國藥典》三部（2010年版）［M］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄：34－37．

［7］Yajima M，Hosoda K，Kanbayashi Y，et al．Islets－activating protein（IAP）in Bordetella pertussis that potentiates insulin secretory responses of rats．Purification and characterization［J］．J Biochem，1978，83（1）：295－303．