人丙酮酸羧化酶異位表達提高中國倉鼠卵巢細胞補料分批培養后期活率

付 托，張存超，靖 鈺，蔣 成，張學光，寇 庚

（1．蘇州大學醫學生物技術研究所，江蘇 蘇州215007；2．第二軍醫大學腫瘤研究所，上海200433）

中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞是目前利用重組DNA技術表達重組蛋白最理想的表達系統［1］，其表達的外源蛋白更接近天然構象。目前，延長細胞生長周期、提高活細胞密度、控制代謝抑制物積累是CHO細胞研究的熱點。

通過操縱細胞凋亡途徑可以影響細胞的生長周期和營養代謝途徑。Dorai等［2］報道抗凋亡基因的表達能改變CHO細胞的乳酸代謝；Jeon等［3］報道在二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞培養中，ldh－a和bcl－2的共表達能減少乳酸的生成并促進細胞生長。因此，調節代謝抑制物的代謝通路，通過影響相關酶的活性和表達可以減少代謝抑制物的累積。乳酸是動物細胞培養過程中的主要代謝廢物之一［4］。Zhou等［5］報道，CHO細胞中乳酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶激酶表達的下降能降低乳酸水平并促進抗體的生成。

人丙酮酸羧化酶（Human pyruvate carboxylase，hPC）是回補途徑的一個代謝酶，能將丙酮酸轉換成草酰乙酸，從而連接糖酵解途徑和三羧酸循環。Kim等［6］研究發現，CHO細胞DG44中hPC的功能性表達能減少乳酸的形成；Easlon等［7］研究發現，在酵母線粒體內過表達蘋果酸脫氫酶有延長酵母壽命的作用；Chong等［8］報道在表達單克隆抗體的重組CHO細胞中過度表達丙酮酸羧化酶會促進細胞的生長。

作者在此以實驗室改造的宿主細胞CHO－K1為研究對象，考察hPC異位表達對其表型的影響，期望獲得細胞生長得到改善的細胞株，為后續的重組蛋白表達提供改善的宿主細胞。

1 實驗

1．1 材料、試劑與儀器

實驗所用細胞 CHO－K1、大腸桿菌E．coli TG1，均為自行保存。

限制性內切酶、PCR試劑及酶類、反轉錄試劑，Takara公司（TaKaRa Code：DRR037A）；G418試劑，Roche公司；DNA片段小量膠回收試劑盒（W5001）、質粒小量抽提試劑盒（W5211），上海華舜公司；RNA提取試劑（貨號：740955．50），MACHEREY－NAGEL公司；淋巴細胞分離液，上海華精生物高科技有限公司；連接試劑盒，Promega公司；轉染試劑盒Lipofectamin 2000，Invitrogen 公 司；ABI 7500 型 Realtime PRC器；葡萄糖氧化酶法試劑盒，南京建成生物。

1．2 方法

1．2．1 hPC表達載體的構建

1．2．1．1 hPC－pGEM－T克隆載體的構建

由GenBank獲得hPC的序列（NM＿000920．3，編碼區核苷酸的長度為3537bp），按照引物設計的基本原則，設計相應引物（表1），盡量在PCR反應的擴增特異性和擴增效率之間取得平衡。以編碼序列中的XhoI酶切位點為界限，將目的序列分為兩段進行擴增，記為hPC－1和hPC－2。引物合成由上海生工生物技術公司完成。

表1 hPC分段擴增引物及PCR條件Tab．1 Primers and PCR conditions of hPC amplification

通過分離人血液淋巴細胞，提取mRNA并反轉錄獲得cDNA，以此作為PCR模板，相關操作按照淋巴細胞分離液和反轉錄試劑操作說明書進行。PCR采用Taq酶進行，退火溫度為50℃，循環數為30個。PCR產物在1．5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并將目的條帶膠回收。膠回收后，將目的產物與pGEM－T載體按照Promega試劑盒操作說明書進行連接。

以連接產物轉化E．coli TG1感受態細菌（TSS法制備），轉化時取一管（100μL）感受態細菌，加入10μL PCR上述連接產物，輕輕混勻后冰浴30min，42℃熱激90s，再冰浴2min。加入450μL含20 mmol·L－1葡萄糖的LB培養液，37℃、200r·min－1下溫和振蕩培養60min，取100μL涂布氨芐青霉素抗性平板。涂布后的平板在室溫放置約20min后置于37℃恒溫培養箱過夜培養（17～20h）。挑選抗性克隆接種于LB培養液，37℃、280r·min－1下培養過夜并進行質粒抽提（操作按照質粒小量抽提試劑盒說明書進行）。所獲質粒經酶切后，進行瓊脂糖電泳檢測。選取含有目的條帶的質粒送樣測序。

1．2．1．2 hPC－pcDNA 3．0表達載體的構建

將測序結果正確的hPC－pGEM－T載體與pcDNA 3．0表達載體分別經酶切后，在1．5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，回收hPC基因及酶切后的pcDNA 3．0。將上述回收產物連接并轉化E．coli TG1感受態細菌，置于37℃培養箱培養過夜。挑選抗性菌株提取質粒并進行酶切鑒定，選取酶切結果與預期一致的質粒測序驗證。

1．2．2 hPC轉染與篩選

使用轉染試劑盒Lipofectamin 2000，以獲得的hPC－pcDNA 3．0表達載體與pcDNA 3．0空載體分別轉染CHO－K1細胞，具體操作按照說明書進行。轉染后陽性細胞篩選使用G418試劑進行，篩選濃度為800 μg·mL－1。獲得G418抗性細胞庫后，用有限稀釋法獲得克隆［9］。有限稀釋法所用培養基為16／DM＋10%FBS＋Gln＋0．8mg·mL－1G418，在96孔板中獲得克隆后轉移到24孔板中進行培養。在24孔板中傳代時，逐步減少血清含量，使之適應到300F無血清培養基（實驗室自制），在此培養基中添加2mmol·mL－1Gln及0．8mg·mL－1G418，獲得懸浮培養的克隆，用于后續鑒定。

1．2．3 hPC的熒光定量PCR檢測

將上述陽性克隆進行熒光定量PCR鑒定，以檢測hPC的相對含量。以β－actin基因作內參，hPC進行熒光定量PCR的引物［10］為：F：tgaagttccgaacagtccat；R：agagtagatggctacggtg，此引物能特異性擴增轉染的hPC，而不能擴增CHO中的PC。PCR采用Taq酶進行，采用兩步法，退火／延伸為60℃、35s，循環數為25個。

1．2．4 hPC轉染效果的驗證

將經過篩選的含hPC－pcDNA 3．0表達載體的CHO－K1細胞以及轉入空載體的CHO－K1細胞在100mL搖瓶中進行補料分批培養。初始接種濃度為5×105個·mL－1，培養體積為30mL。接種細胞時記為第0h，每隔24h取樣200μL細胞懸液用臺盼藍染色并計數，計算每日的活細胞密度（Viable cell density，VCD）與細胞活率（Viability）。初始培養基為300 F＋4mmol·L－1Gln，72h添加3%300S及1mmol·L－1Gln并添加葡萄糖至2．5g·L－1。之后，每天補葡萄糖至2．5g·L－1；隔天補1mmol·L－1Gln。當細胞活率普遍低于70%時停止培養。

2 結果與討論

2．1 hPC基因克隆及表達載體的構建

2．1．1 hPC基因分段克隆

hPC基因以XhoI為界，分為兩段分別克隆。前、后段分別記為hPC－1和hPC－2，長度分別為1666bp和1871bp。hPC基因經PCR擴增后，在1．5%瓊脂糖凝膠中電泳，回收目的條帶并與pGEM－T載體連接。

2．1．2 表達hPC的E．coli陽性菌株挑選

以hPC前后段分別與pGEM－T載體的連接產物轉化E．coli TG1感受態細菌，并分別挑選具有氨芐青霉素抗性的克隆5個。將這10個克隆在搖瓶中培養后抽提質粒，含有hPC－1、hPC－2的克隆載體分別用HindⅢ、XhoⅠ及Eco RⅠ、XhoⅠ酶切，電泳結果見圖1。

圖1 挑選菌株中質粒酶切電泳鑒定結果Fig．1 Electrophoresis results of hPC inserted vector from picked clone

由圖1可看出，hPC－1－pGEM－T質粒1＃、2＃的條帶位置與預期一致，hPC－2－pGEM－T質粒8＃的條帶與預期一致，將這些質粒用于測序鑒定。結果顯示，hPC－1的1＃克隆和hPC－2的8＃克隆中目的條帶序列與預期一致，可用于表達載體構建。

2．1．3 表達載體的構建

hPC－1的1＃克隆和hPC－2的8＃克隆中質粒分別用HindⅢ、XhoⅠ及Eco RⅠ、XhoⅠ雙酶切，并回收PC－1及PC－2，兩者與經 Hind Ⅲ、Eco RⅠ酶切之后的pcDNA 3．0表達載體連接。連接產物經轉化、挑選克隆、克隆培養及質粒提取后，獲得的質粒1＃～5＃均用Eco RⅠ、XhoⅠ和HindⅢ酶切，并在1．5%瓊脂糖凝膠中電泳，結果見圖2。

圖2 表達載體酶切電泳鑒定結果Fig．2 Expression vectors verified by electrophoresis after digestion by Eco RⅠ，XhoⅠ and Hind Ⅲ

由圖2可看出，克隆1＃、2＃和3＃中的相應質粒經酶切后的片段大小與預期一致。挑選1＃質粒測序，顯示其PC序列與目的序列一致，可用于后續實驗。至此，已成功構建表達載體hPC－pcDNA 3．0。

2．2 hPC的mRNA水平鑒定

以hPC－pcDNA 3．0和pcDNA 3．0載體分別轉染CHO－K1，轉染使用試劑 Lipofectamin 2000。轉染后挑選G418抗性克隆并提取總RNA，用熒光定量PCR法鑒定hPC的表達，結果見圖3。

圖3 Real－time PCR鑒定hPC的 mRNA水平Fig．3 Relative hPC mRNA quantity determined by real－time PCR

由圖3可看出，2＃、4＃和6＃均表達hPC，而且4＃克隆的hPC表達量最高，將其用于后續實驗，記為hPC 4＃。

2．3 hPC表達對CHO細胞生長及活率的影響

以hPC 4＃克隆為研究對象，考察hPC異位表達對CHO細胞生長和活率的影響。培養方式為補料分批培養，每24h計數，并繪制生長曲線，如圖4所示。以轉染pcDNA 3．0的克隆4＃作為對照。

圖4 hPC異位表達對細胞生長和活率的影響Fig．4 Effect of hPC ectopic expression on cell growth and viability

由圖4可看出，培養前期，hPC 4＃細胞的活細胞密度和活率與對照沒有明顯差別；培養6d后，hPC 4＃細胞的活細胞密度與活率明顯高于對照。這表明，hPC在CHO細胞中表達改善了細胞的生長，并提高了補料分批培養后期細胞的活率。

2．4 討論

hPC在CHO細胞中表達提高了活率，這可能是由于，hPC表達抑制了細胞凋亡，進而提高了細胞活率。hPC表達是否抑制了凋亡，以及通過何種方式抑制凋亡，還需要進一步研究確定。

在無血清培養基中添加pH值指示劑酚紅進行實驗。結果發現，細胞培養后期，hPC表達的細胞培養上清顏色比對照偏紅，說明其培養上清pH值高于對照。由于在補料分批培養后期，乳酸是影響pH值的重要因素，因此hPC表達可能減少乳酸生成。因此，hPC對細胞的作用也可能是通過減少乳酸累積來進行的。在細胞培養前中期，乳酸積累量較少，對細胞生長未有明顯抑制作用，而到后期，乳酸累積的抑制作用明顯。hPC的表達可增加碳進入TCA循環的流量，減少乳酸的積累，從而提高活細胞密度與活率，并延長細胞培養時間。

3 結論

成功構建了人丙酮酸羧化酶（hPC）表達載體，將其轉入CHO－K1細胞中表達，并對重組細胞生長情況進行驗證。結果表明，hPC異位表達能提高CHO細胞在培養后期的活率，獲得了生長改善的細胞株，為后續的重組蛋白表達研究與細胞培養工藝優化奠定了基礎。

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