粘質(zhì)沙雷氏菌G1利用玉米漿干粉和磷酸氫二銨生產(chǎn)2，3－丁二醇的研究

郝英利，張燎原，孫建安，魏東芝，周文瑜，沈亞領(lǐng)，朱家文

（1．華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 魯華生物技術(shù)研究所，上海200237；2．華東理工大學(xué)化工分離研究所，上海200237）

隨著儲(chǔ)量有限的傳統(tǒng)能源的日益匱乏，新興的可再生生物能源引起人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾暋?，3－丁二醇（2，3－Butanediol，BD）具 有 高 燃 燒 值 （27 200kJ·kg－1）和低冰點(diǎn)，是一種優(yōu)良的低溫環(huán)境下的燃料添加劑［1，2］。2，3－丁二醇用途十分廣泛：可以制備多種衍生物，脫水可生成甲乙酮，是廣泛應(yīng)用于電子元件清洗、涂料、染料、印刷油墨、煉油等多個(gè)領(lǐng)域的工業(yè)溶劑［3－5］；脫水轉(zhuǎn)化生成1，3－丁二烯，是合成橡膠的重要前體［6，7］；脫氫轉(zhuǎn)化生成3－羥基－2－丁酮（乙偶姻，AC），是具有多種用途的天然食用香料［8］；和乙酸可催化合成2，3－丁二醇二乙酸酯，廣泛應(yīng)用于奶制品行業(yè)中，用于改善風(fēng)味［9，10］；通過 Diels－Alder反應(yīng)可轉(zhuǎn)化為苯乙烯［11］；合成聚氨酯泡沫材料，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、藥品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域［12］；是一種優(yōu)良的白酒風(fēng)味添加劑，適當(dāng)添加可大大提高酒類的口感［1］。

由于2，3－丁二醇具有2個(gè)手性碳原子、3種同分異構(gòu)體，生物法制備2，3－丁二醇極具優(yōu)勢(shì)，因而得到了廣泛的研究，高產(chǎn)2，3－丁二醇的報(bào)道［13］也比較多。然而，多數(shù)研究利用的是昂貴的實(shí)驗(yàn)級(jí)有機(jī)氮源［14］，價(jià)格較高、不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

作者在此利用基因改造過的粘質(zhì)沙雷氏菌G1，以玉米漿干粉（CSLP）和磷酸氫二銨［（NH4）2HPO4］為氮源發(fā)酵生產(chǎn)2，3－丁二醇，降低了培養(yǎng)基的成本，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 菌種和培養(yǎng)基

出發(fā)菌株：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）G1，實(shí)驗(yàn)室保藏，保存于－80℃甘油管中。

斜面培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨5，瓊脂20，以NaOH調(diào)pH 值7．2。

種子培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，（NH4）2SO46，KH2PO410，NaCl 0．5，MgSO40．5，以 NaOH 調(diào)pH 值7．2，115℃滅菌20min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g·L－1）：蔗糖90，酵母粉30，（NH4）2HPO43，NaAc 4，檸檬酸鈉14，MgSO40．5，F(xiàn)eSO40．02，MnSO40．01。

1．2 培養(yǎng)方法

1．2．1 種子培養(yǎng)

在250mL搖瓶中裝入30mL種子培養(yǎng)基，接一甘油管種子至種子培養(yǎng)基中，于30℃、200r·min－1下?lián)u床培養(yǎng)12h。

1．2．2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按5%（體積比）的接種量轉(zhuǎn)接種子至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于30℃、200r·min－1下?lián)u床培養(yǎng)。

1．2．3 分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)

取100mL種子液接種于3．7L比歐發(fā)酵罐（KL F2000），起始裝液量為2L，轉(zhuǎn)速為300r·min－1，通氣量為0．8VVm，初始糖濃度為90g·L－1，當(dāng)殘?zhí)牵≧G）濃度低于5g·L－1時(shí)，用蠕動(dòng)泵補(bǔ)料補(bǔ)入800g·L－1蔗糖溶液，控制蔗糖濃度5～10g·L－1。

1．3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

工業(yè)氮源的初篩：分別以價(jià)格低廉的工業(yè)氮源復(fù)合氨基酸、黃豆餅粉、可溶性氮源、玉米漿干粉替代酵母粉配制發(fā)酵培養(yǎng)基，4種氮源的濃度均為30g·L－1。

培養(yǎng)基的優(yōu)化：配制不同濃度玉米漿干粉發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)；應(yīng)用Minitab軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)Plackett－Burman（PB）實(shí) 驗(yàn) 優(yōu) 化 玉 米 漿 干 粉、（NH4）2HPO4及無機(jī)鹽的配比；根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定爬坡步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)爬坡實(shí)驗(yàn)；根據(jù)爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Minitab軟件系統(tǒng)，進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)，進(jìn)行2因子5水平的組合實(shí)驗(yàn)。

發(fā)酵罐驗(yàn)證：采用恒底物濃度策略［14］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．4 分析方法

菌體濃度測(cè)定：采用UV22008H 型分光光度計(jì)（Unic）在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定OD600。

發(fā)酵液中殘?zhí)牵?4，15］測(cè)定：將樣品離心，取上清液用2mol·L－1H2SO4溶液水解，再用4mol·L－1NaOH溶液中和，用葡萄糖液體試劑盒（上海捷門生物技術(shù)公司）測(cè)定葡萄糖的濃度，再換算成殘?zhí)菨舛取?/p>

產(chǎn)物［14，15］測(cè)定：用 Aglient GC9860型氣相色譜儀測(cè)定AC和BD的濃度。色譜柱采用毛細(xì)管柱DB－5，F(xiàn)ID氫火焰檢測(cè)器，氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為1mL·min－1，柱溫為50℃保留115min、然后25℃·min－1程序升溫到180℃保留10min，進(jìn)樣口溫度為215℃，檢測(cè)器溫度為245℃。發(fā)酵液離心后用乙酸乙酯萃取，再用氣相色譜儀測(cè)定濃度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)物濃度。

2 結(jié)果與討論

2．1 工業(yè)氮源的篩選（圖1）

圖1 不同工業(yè)氮源對(duì)產(chǎn)物的影響Fig．1 Effect of different industrial nitrogen sources on product

由圖1可知，復(fù)合氨基酸作為氮源時(shí)，生物量較低；黃豆餅粉和可溶性氮源作為氮源時(shí)，產(chǎn)物濃度較低，雜質(zhì)較多；玉米漿干粉作為氮源時(shí)，不僅能夠滿足菌體的生長(zhǎng)，而且利于2，3－丁二醇的積累。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇玉米漿干粉作為培養(yǎng)基氮源。

2．2 單因素實(shí)驗(yàn)（圖2）

圖2 玉米漿干粉濃度對(duì)產(chǎn)物的影響Fig．2 Effect of CSLP concentration on product

由圖2可知，玉米漿干粉濃度在20g·L－1左右時(shí)已經(jīng)可以滿足菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成的需要。

2．3 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)篩選培養(yǎng)基中顯著因素

應(yīng)用Minitab軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)PB實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)酵培養(yǎng)基顯著因素，實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 PB實(shí)驗(yàn)因素與水平／g·L－1Tab．1The factors and levels of PB experiment／g·L－1

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab．2 The design and results of PB experiment

PB實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Minitab 15．0軟件分析得到擬合方程如下：

式中：Y 為2，3－丁二醇濃度，g·L－1。

PB 實(shí) 驗(yàn) 的 R－Sq為 99．03%、R－Sq（adj．）為96．44%，說明模型對(duì)產(chǎn)物水平的變化有良好擬合度。其中玉米漿干粉、（NH4）2HPO4的P值分別為0．014與0．007，說明玉米漿干粉與（NH4）2HPO4對(duì)2，3－丁二醇濃度的影響最顯著。

2．4 爬坡實(shí)驗(yàn)

爬坡實(shí)驗(yàn)中玉米漿干粉與（NH4）2HPO4的濃度變化按照PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果逐步增加。步長(zhǎng)（4．873，6．279）近似為（1，1．25），即玉米漿干粉濃度每增加1個(gè)單位（4g·L－1），（NH4）2HPO4增加1．25g·L－1，結(jié)果如圖3所示。

圖3 爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig．3 Results of the steepest ascent experiment

由圖3可知，隨著玉米漿干粉濃度的增大，蔗糖的消耗速率逐漸加快，2，3－丁二醇的濃度不斷提高；當(dāng)玉米漿干粉濃度大于20g·L－1、（NH4）2HPO4濃度大于7g·L－1時(shí)，菌體的生長(zhǎng)和代謝逐漸受到抑制。這是因?yàn)椋邼舛鹊模∟H4）2HPO4會(huì)產(chǎn)生游離的氨，對(duì)細(xì)胞有毒性，造成了對(duì)生長(zhǎng)和代謝的抑制。

2．5 中心組合和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

玉米漿干粉（X1）和（NH4）2HPO4（X2）的中心點(diǎn)分別取20g·L－1和7g·L－1，其它培養(yǎng)基組分（g·L－1）如下：蔗糖90、NaAc 4、檸檬酸鈉14、MgSO40．5、FeSO40．02、MnSO40．01，進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)，其設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

表3 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab．3 The design and results of the central composition experiment

中心組合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析經(jīng) Minitab 15．0軟件分析得到擬合方程如下：

Y＝42．7406＋0．9245 X1＋0．2210 X2－1．52 X21－1．0502 X＋0．0313 X1X2

式中：Y 為2，3－丁二醇濃度，g·L－1。

中心組合實(shí)驗(yàn)的R－Sq為96．43%、R－Sq（adj．）為93．88%，表明模型可以解釋93．88%的發(fā)酵水平的變化。根據(jù)回歸方程，利用Minitab 15．0軟件繪制響應(yīng)面立體圖，見圖4。

圖4 響應(yīng)面立體圖Fig．4 The three－dimensional graph for the response surface

由圖4可以看出，兩個(gè)因素之間交互作用不顯著，最佳點(diǎn)落在實(shí)驗(yàn)考察的區(qū)域內(nèi)。為了進(jìn)一步求證最佳點(diǎn)的值，對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)，通過回歸方程計(jì)算得到最優(yōu)的培養(yǎng)基組分濃度為：玉米漿干粉20．32g·L－1、（NH4）2HPO47．21g·L－1，2，3－丁二醇濃度預(yù)測(cè)值為42．74g·L－1。由此確定的優(yōu)化培養(yǎng)基（g·L－1）為：蔗糖90，玉米漿干粉20．32，（NH4）2HPO47．21，NaAc 4，檸檬酸鈉14，MgSO40．5，F(xiàn)eSO40．02，MnSO40．01。

為驗(yàn)證響應(yīng)的最優(yōu)值的可信度，共進(jìn)行了3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，18h時(shí)的2，3－丁二醇濃度分別為43．72g·L－1、42．45g·L－1和43．02g·L－1，平均值為43．06 g·L－1，與預(yù)測(cè)值42．74g·L－1基本吻合。

2．6 發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在3．7L發(fā)酵罐中采用上述優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

圖5 粘質(zhì)沙雷氏菌G1的分批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果Fig．5 The fed－batch fermentation result of Serratia marcescens G1

由圖5可以看出，AC濃度為8．35g·L－1、2，3－丁二醇濃度為128．28g·L－1，2，3－丁二醇的產(chǎn)率為2．67g·L－1·h－1、轉(zhuǎn)化率為0．48g·g－1蔗糖。表明以玉米漿干粉、（NH4）2HPO4為氮源，能夠大大降低2，3－丁二醇工業(yè)化生產(chǎn)中培養(yǎng)基原料的成本，提高了工業(yè)化的經(jīng)濟(jì)可行性。

2．7 討論

為了提高工業(yè)化生產(chǎn)2，3－丁二醇的經(jīng)濟(jì)可行性，可以采取多種方法，如傳統(tǒng)的篩選高產(chǎn)菌株、基因改造高產(chǎn)菌株［16］、設(shè)計(jì)優(yōu)化便宜有效的培養(yǎng)基等。本研究采用的粘質(zhì)沙雷氏菌G1菌株為基因工程菌，具有副產(chǎn)物濃度低、發(fā)酵過程氣泡少、無紅色素等特點(diǎn)。副產(chǎn)物濃度低，從發(fā)酵原理上簡(jiǎn)化了發(fā)酵控制難度；發(fā)酵過程氣泡少，從實(shí)際操作上降低了發(fā)酵控制的難度；菌體不產(chǎn)紅色素，有利于發(fā)酵液的后續(xù)處理。上述特點(diǎn)使得該菌株非常適于工業(yè)化生產(chǎn)。

在之前的基礎(chǔ)研究中［14］，實(shí)驗(yàn)采用較為昂貴的實(shí)驗(yàn)級(jí)有機(jī)氮源，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，本研究從2，3－丁二醇工業(yè)化生產(chǎn)的角度出發(fā)，篩選了多種工業(yè)氮源，最終確定玉米漿干粉和（NH4）2HPO4為氮源。

玉米漿干粉是玉米深加工行業(yè)的主要副產(chǎn)品，來源豐富、價(jià)格便宜［17］，其中含有47%的粗蛋白，實(shí)驗(yàn)表明玉米漿干粉能夠滿足菌體生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化的需要，有利于積累較高的產(chǎn)物濃度。（NH4）2HPO4作為農(nóng)用肥具有價(jià)格低、供應(yīng)大、含氮量高等特點(diǎn)，可作為有機(jī)氮源的有力補(bǔ)充，滿足菌體的生長(zhǎng)，且磷酸根能夠刺激2，3－丁二醇的合成［18］。

優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方除糖外，只有少量的玉米漿干粉和便宜的無機(jī)鹽，降低了培養(yǎng)基的成本，為2，3－丁二醇的規(guī)?；?、工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

篩選玉米漿干粉和（NH4）2HPO4作為粘質(zhì)沙雷氏菌G1發(fā)酵產(chǎn)2，3－丁二醇的氮源，通過PB實(shí)驗(yàn)、中心組合和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成（g·L－1）為：蔗糖90，玉米漿干粉20．32，（NH4）2HPO47．21，NaAc 4，檸檬酸鈉 14，MgSO40．5，F(xiàn)eSO40．02，MnSO40．01。搖瓶發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果表明以玉米漿干粉和（NH4）2HPO4作氮源，2，3－丁二醇濃度較高，培養(yǎng)基的成本大幅降低，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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