生物合成二酮哌嗪類化合物的環二肽合酶研究進展

韓 偉，高菊芳

（上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234）

環二肽（Cyclodipeptides）是二酮哌嗪衍生物（Diketopiperazines，DKPs）家族中的一類化合物，在最初多肽的化學合成中被作為副反應產物［1，2］，也是微生物的次級代謝產物中比較龐大的一類化合物。DKPs骨架是穩定的六元環，有2個氫鍵給體和2個氫鍵受體，而氫鍵被認為是藥物與受體相互作用的一種方式，是非常重要的藥效基團［3，4］。DKPs具有廣泛的生物活性和藥理學活性［5，6］，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及類似免疫抑制劑的活性［7，8］，同時有研究認為DKPs是潛在的血腦屏障跨膜載體［9］。

人們在很長一段時間里認為自然界中環二肽的DKPs骨架只由非核糖體肽合成酶（Nonribosomal peptide synthases，NRPSs）參 與 催 化 合 成［10，11］。NRPSs是一大類多功能酶，由多個模塊（Module）按一定的空間順序組合而成，每一個模塊能獨立地將一個氨基酸整合到肽鏈上。一個典型的模塊由縮合（Condensation，C）結構域、腺苷酰化（Adenylation，A）結構域和肽酰載體蛋白（Peptidyl carrier protein，PCP）結構域組成。以硫酯的形式通過幾個模塊將游離的氨基酸形成肽鍵，從而延伸肽鏈的長度，最終在硫酯酶（Thioesterase，TE）結構域的作用下以水解或者環化的方式將肽鏈解離下來［12］，形成非核糖體肽類化合物。

之后，人們發現環二肽合酶（Cyclodipeptide synthases，CDPSs）也能參與催化DKPs類化合物的合成。這類酶能夠直接跳過在NRPSs途徑中A結構域活化氨基酸的步驟，利用現成的氨酰－tRNA（aa－tRNA）而不是游離的氨基酸作為底物來形成環二肽類化合物。近幾年的研究揭示了CDPSs的晶體構型和獨特的催化機制，作者在此就近年來CDPSs的研究進展進行綜述。

1 CDPSs——新發現的催化合成環二肽骨架的一類酶

首先被發現的CDPS是2002年Sylvie等報道的諾爾斯氏鏈霉菌（Streptomyces noursei）中的albC基因，其編碼的AlbC蛋白是一個非常小的酶，能夠催化合成白諾氏菌素（Albonoursin，圖1a）的骨架結構1－cyclo（α，β－dehydroPhe－α，β－dehydroLeu）（cFL），但 是與NRPSs幾乎沒有同源性，并且與任何已知的功能性蛋白均沒有相關性［13，14］。與NRPSs催化合成環二肽的方式不同，CDPSs利用aa－tRNA而不是游離狀態的氨基酸作為底物。隨著研究的深入，Gondry等［13］確定其為一類新的參與催化合成DKPs結構的酶并被命名為環二肽合酶（CDPS）。

圖1 白諾氏菌素（a）、Mycocyclosin（b）、普切明（c）的結構Fig．1 Structures of albonoursin（a），mycocyclosin（b），pulcherrimin（c）

此后報道了2個合成DKPs結構的CDPSs：結核分枝 桿 菌 （Mycobacterium tuberculosis）菌 株 中 的rv2275基因編碼的Rv2275蛋白，催化合成Mycocyclosin（圖1b）的骨架結構cyclo（L－Tyr－L－Tyr）（cYY）［15］；地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）菌株中的 YvmCBlic蛋白，催化合成普切明（Pulcherrimin，圖1c）的骨架結構 Cyclodileucine（cLL）［16］。通過對其晶體結構以及生物信息學進行分析，確定這2個蛋白屬于CDPSs家族。對AlbC、Rv2275、YvmC－Blic以及一些潛在的CDPSs蛋白進行多序列比對（圖2），發現這些CDPSs的同源性較低，僅有20%～26%的相似性［16］。結合突變實驗，Gondry等［13］和 Sauguet等［17］認為，2個特殊的連續序列GxSxxN（Ser是與氨基酸結合的活性位點，Asn處的氨基酸主要為Asn變為其它極性氨基酸如Thr，也具有活性）和YxxxExP與CDPSs的催化功能有關［13］。

圖2 7個CDPSs序列比對Fig．2 Protein sequence alignments of seven CDPSs（The catalytic residues are shown by a black background）

對AlbC、Rv2275、YvmC－Blic三個蛋白進行生化實驗發現，純化后的CDPSs蛋白利用帶電荷的tRNAs（Charged tRNAs）來合成非核糖體肽類的次級代謝產物——二酮哌嗪類化合物［8，13］。這與 NRPSs（需要以游離的氨基酸作為底物）催化二酮哌嗪類化合物的合成不同。

2 CDPSs是一類以aa－tRNA作為底物的酶

目前已知的在微生物中利用aa－tRNA作為底物來合成代謝產物的酶共有5類：

（1）谷氨酰還原酶，它能將Glu－tRNA上的谷氨酸解離下來作為合成卟啉（Porphyrin）的底物；（2）氨基酸－磷酸甘油酯合成酶，它能利用aa－tRNA使細胞膜上的磷脂氨酰化；（3）FemXAB家族蛋白，它們參與肽聚糖的生物合成；（4）L／F轉移酶，它參與蛋白質的翻轉作用［8，16］；（5）環二肽合成酶。前4類酶參與細菌的初級代謝，且只能催化2個氨基酸形成1個肽鍵，而CDPSs與前4類酶幾乎沒有相似的保守序列，催化活性區域也不同，且參與次級代謝產物的合成，催化2個aa－tRNA形成含2個肽鍵的環二肽化合物［17］。

已經取得很好研究進展的3個CDPSs（AlbC、Rv2275、YvmC－Blic）的蛋白晶體結構與酪氨酸－tRNA合成酶（Tyr－tRS，Ⅰ型aa－tRSs）的催化結構域的結構非常相像，如AlbC和Rv2275的蛋白晶體結構與來源于詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）的 TyrtRS、YvmC－Blic的蛋白晶體結構與來源于酵母的Tyr－tRS的構型就比較接近［15－17］。

氨基酸－tRNA 合成酶（aa－tRSs）催化氨基酸和tRNA形成aa－tRNA的過程分為兩個步驟：首先在ATP存在下，活化氨基酸形成酶聯氨基酸中間體；然后將酶聯氨基酸中間體上的氨基酸轉移到相對應的tRNA 上 形 成 aa－tRNA［18，19］。與 aa－tRSs不 同 的 是：CDPSs直接利用aa－tRNA作為底物從而催化形成二酮哌嗪類化合物。

3 CDPSs與Ⅰ型aa－tRSs結構上的異同

Ⅰ型aa－tRSs（Tyr－tRS和 Trp－tRS）的催化結構域中含有 Rossmann折疊（Rossmann fold）和 CP1（Connective－polypeptide）［18，20］，在已經明確晶體結構的3個CDPSs中發現類似的結構。3個CDPSs中也能找到與Ⅰ型aa－tRSs中氨基酸結合口袋結構相對應的活性氨基酸，由此可以認為CDPSs是HUP家族的一個新成員［21］。

但是Ⅰ型aa－tRSs與CDPSs蛋白的晶體結構有6個明顯的區別：（1）Ⅰ型aa－tRSs中標志性的與ATP結合相關的模體如HIGH和KMSKS，在CDPSs中沒有被發現，而且在Ⅰ型aa－tRSs中一些與ATP活化相關的氨基酸殘基也不存在于CDPSs中，而是替換成其它的氨基酸，這表明CDPSs不能利用ATP來活化氨基酸生成aa－tRNA［17］。（2）Ⅰ型aa－tRSs是以同源二聚體的形式將2個活性位點交錯結合在二聚體的表面，每個單體與一個aa－tRNA交聯。而CDPSs的寡聚化狀態與其不同，AlbC和YvmC－Blic是以單體（溶液中的晶體分析）形式存在，可能是它們與aa－tRNA結合后導致的二聚化（Ⅰ型aa－tRSs就是一類功能化二聚體，雖然在溶液中能得到它的二聚體），但是在CDPSs的催化結構域中疏水表面的氨基酸殘基（它們能夠幫助二聚體的形成）并不保守。Sauguet等［17］對AlbC進行二聚化模擬，發現二聚化后的AlbC會發生催化口袋的物理分離，從而導致不能形成雙肽鍵。Rv2275雖然以同源二聚體的形式存在，但是其與二聚化相關的氨基酸殘基在CDPSs中不是保守氨基酸，而且其催化口袋和活性氨基酸并不在二聚體的表面，而是分離的，而Ⅰ型aa－tRSs的活性位點存在于其雙結構域的表面。Rv2275中具有明顯的重排結構，能夠阻止其與ATP的結合［22］。（3）已知的CDPSs晶體數據表明它們的催化口袋開口非常窄，游離的氨基酸或aatRNA不能夠自由通過，這也與Ⅰ型aa－tRSs不同。推測CDPSs的催化口袋處于一種關閉的狀態，在有tRNA與其結合后才能打開，從而實現其催化作用［16］。（4）CDPSs的CP1區域有一個很長的Loop結構［16］。（5）CDPSs中有一段很長的富含帶正電氨基酸的序列，而Ⅰ型aa－tRSs沒有這種現象。通過廣泛的基因突變研究發現，AlbC中的堿性堿基對于環二肽的合成非常重要。YvmC－Blic中堿基的等電替換能夠使其具備與tRNA結合的活性。從而推測這些帶正電的堿性氨基酸可能與tRNA結合有關［8］。（6）CDPSs有一些新的活性位點，如Ser位點，研究表明Phe與AlbC的Ser37形成共價鍵，Rv2275的對應的Ser88被證實是結合氨基酸的活性位點［15］。此外還有研究表明，YvmC－Blic中的Tyr180和Glu184與識別LeutRNALeu的亮氨酸基團有關，在Rv2275以及YvmCBlic催化口袋入口處的幾個保守氨基酸可能與其催化合成環二肽的機制有關，Rv2275催化口袋上的Asn251能夠識別底物上酪氨酸部分的羥基基團，在YvmC－Blic中替換為Leu202后與底物中亮氨酸部分的識別有關［16］。

通過CDPSs和Ⅰ型aa－tRSs結構異同的比較可以較好地解釋CDPSs為什么能利用aa－tRNA而不是游離的氨基酸作為底物來形成肽鍵的原因。

4 CDPSs的催化機制（圖3）

CDPSs與aa－tRSs和氨基酸結合部分結構比較相像，催化形成肽鍵的機制有一定的相似性。已有的研究數據表明CDPS可能的催化機制是：利用2分子的aa－tRNA作為底物，通過一個連續的乒乓反應（Pingpong reaction）合成環二肽。其催化步驟分為三步：首先CDPSs位于酶催化口袋上的Ser（AlbC中是Ser37）的羥基基團作為親核試劑進攻第一個aa－tRNA，并在 Tyr和 Glu（AlbC中分別是 Tyr178和Glu182）的矯正下（與氨酰基團以氫鍵結合）使氨基酸部分結合到CDPSs上而tRNA分離，形成一個氨酰－CDPSs共價中間體；然后氨酰－CDPSs共價中間體的氨基酸基團進攻結合到CDPSs上的第二個aa－tRNA的酯鍵，tRNA分離，形成二肽－CDPSs或者二肽－tRNA中間體；最后，二肽－CDPSs或者二肽－tRNA中間體經過分子內催化形成最終的環二肽骨架（DKPs）結構［8，16］，這與NRPSs蛋白催化合成環二肽類化合物的機制不同。目前還沒有報道證實這兩個推測的中間體的存在。

5 DKPs骨架形成后的后修飾

圖3 CDPSs劫持aa－tRNA作為底物合成環二肽化合物和核糖體利用aa－tRNA合成核糖體肽的對比圖Fig．3 The comparison of CDPSs hijack aa－tRNA to produce cyclodipeptides and the ribosome use aa－tRNA for the synthesis of peptide bonds

環二肽類化合物的骨架DKPs形成后，還需要一些后修飾才能形成結構復雜的環二肽化合物［23］。對比已知的CDPSs與NRPSs參與的環二肽形成，可以發現CDPSs催化合成DKPs中間體［13］，然后在各種后修飾酶（大部分為氧化酶）的作用下，形成最終的環二肽化合物。目前通過基因組挖掘（Genome mining）發現與CDPSs基因簇共同起作用的后修飾的氧化酶有6類：細胞色素P450、FAD或NADH依賴的氧化酶、F420依賴的單加氧酶、α－酮戊二酸依賴的雙加氧酶、鐵氧化還原蛋白依賴的單加氧酶、α螺旋雙鐵氧化酶［21］。通過與CDPSs相連的后修飾酶的修飾作用，使得最終化合物的結構更豐富。目前已有3個編碼CDPSs蛋白的基因被研究透徹，與它們相連的后修飾蛋白的后修飾作用沒有共性，而是表現為3種不同的修飾形式：（1）細胞色素P450的CypX參與的二酮哌嗪環的氧化；參與Pulcherrimin形成的yvmC－cypX基因編碼的CypX即CYP134A1蛋白是首個被發現的參與CDPSs生物合成的P450氧化酶［8］。它是血紅素（Heme）依賴的單加氧酶，需要Fe3＋作為外源性電子供體才能發揮其氧化酶活性，從而形成最終的化合物Pulcherrimin［16］。（2）Rv2275蛋白催化后的細胞色素P450參與的C－C芳基偶聯；在Mycobacterium tuberculosis中發現的CYP121蛋白是研究比較透徹的環二肽后修飾酶，它與其它已知的P450氧化酶的功能不同，也參與產生菌株的脂代謝［24］。CYP121蛋白與Rv2275不僅在物理位置上是緊密相連的，而且共同參與了從Tyr－tRNA到Mycocyclosin的生物合成［8，25］，CYP121蛋白使DKP環上的2個 Tyr側鏈以C－C鍵偶聯形成Mycocyclosin。（3）環二肽氧化酶（Cyclodipeptide oxidase，CDO）參與的α，β－脫氫反應，在很多微生物的次級代謝中α，β－脫氫氨基酸很常見［26］。CDO對許多環二肽的DKP環有活性，但是對線性二肽卻沒有作用，并且該酶對芳香族的氨基酸側鏈有更好的活性。CDO在黃素作為輔因子的情況下，以O2作為電子供體同時產生副產物H2O2，催化環二肽的脫氫反應［8］。在大腸桿菌中AlbC和CDO共表達能夠產生白諾氏菌素［14］。

6 CDPSs存在的廣泛性

Belin等［8］運用生物信息學的方法，在50種不同細菌的基因組中找到可能編碼CDPSs的基因，而且分布在不同的物種如放線菌、衣原體、真菌中，甚至在動物Platynereis dumerilii中也找到可能編碼CDPSs的基因。他們通過對49個完整的可能CDPSs序列進行分析，最終確定了27個序列是可以被鑒定的，其中有18個是新的可以確定的CDPSs序列。但是就目前的數據來看，CDPSs并沒有嚴格意義上的標志性蛋白序列，因此很難預測某個CDPSs催化形成其種產物，而且CDPSs蛋白的容忍性比較大，例如：AlbC在重組大腸桿菌中能夠催化形成cFF、cFY、cFM、cYM、cYL、cLM、cLL、cMM 等多個化合物［8，17］。

7 NRPSs與CDPSs兩種生物合成DKPs體系的對比

在自然界中，CDPSs和NRPSs體系都可以用來形成DKPs結構，但它們是有區別的：（1）NRPSs是一個多酶復合體，在合成DKPs時需要參與的蛋白很多，而CDPSs是一個非常小的酶（26kDa左右［8］）。它們在大小上的不同是由于它們在形成肽鍵時采用的策略不同造成的：NRPSs需要A結構域識別、活化氨基酸并將其與T結構域以硫酯鍵連接，而CDPSs劫持現有的aa－tRNA參與合成化合物，沒有氨基酸活化這個步驟。從而導致CDPSs只能利用20種結合在tRNA上的天然氨基酸作為底物來合成DKPs結構，而NRPSs識別的氨基酸就不局限于天然氨基酸，如利用鄰氨 基 苯 甲 酸 來 合 成 Acetylaszonalenin［27］。 （2）NRPSs能夠在與底物結合后對其進行修飾如甲基化，CDPSs途徑只能在形成DKPs結構后通過后修飾酶的作用［21］形成最終化合物。因此，NRPSs途徑合成的化合物的骨架具有更多的結構類型。

8 展望

雖然CDPSs可能的催化機制已被闡明，也通過生物信息學的方法找出了許多相關的蛋白，但是目前只有3個CDPSs蛋白被詳細地闡明。與它們相連的后修飾酶也有3種不同的類型，因此，CDPSs體系相連的后修飾酶是否有共性、是否能找到類似NRPSs中甲基化等修飾作用的蛋白還需要進一步研究。Gondry等［13］對AlbC的改造證明了進行CDPSs改造的可行性，再加上CDPSs本身比較小的特性使其在酶工程中更容易改變和操作產生新的環二肽化合物。CDPSs是否從Ⅰ型aa－tRSs進化而來、改造Ⅰ型aa－tRSs能否形成CDPSs還需要進一步研究。隨著新的CDPSs被發現和機制的闡明，更多的具有生物活性的DKPs化合物將會被發現。

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