補體C3a、類胰蛋白酶與羊水栓塞關系的研究＊

李 偉，余 艦，龍艷麗，趙 敏，張國棟

（1.湖北省咸寧市第一人民醫院病理科 437000；2.貴州省遵義醫學院附屬醫院法醫鑒定中心 563003；3.貴州省遵義醫學院法醫系 563003；4.廣西桂林醫學院公共衛生學院 541000）

羊水栓塞（amniotic fluid embolism，AFE）是產科發生率低卻兇險的并發癥之一，嚴重威脅母嬰安全［1］，且AFE的病死率并未隨著醫療的進步而有所降低［2］。羊水及其有形成分進入母體循環后如何導致機體出現一系列病理生理變化，迄今為止依然不十分清楚。Benson等［3］認為其發病機制可能是無抗體參加的過敏樣反應，羊水進入母體后激發內源性介質的釋放，建議將AFE稱之為“妊娠過敏樣綜合征”，與此相關的介質有補體C3a、類胰蛋白酶等［4］。本課題以28例尸檢病例為研究對象，采用免疫組織化學法來檢測補體C3a、類胰蛋白酶等在肺組織中的表達，從免疫介導的過敏角度初步研究與探討AFE可能的發病機制，試圖為AFE的診斷提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究的標本均來自遵義醫學院附屬醫院病理科及遵義醫院。選取近10年產科尸檢病例28例，臨床高度懷疑尸檢明確診斷為AFE病例4例（AFF組）；臨床診斷為產后出血而尸檢及蘇木素－伊紅（HE）染色未發現羊水有形成分的病例16例，包括HE染色高度可疑AFE病例（PHH組）；其他8例（陰性對照組）死因分別為：妊娠期高血壓疾病、麻醉意外、晚孕疤痕子宮破裂、妊娠期外傷等。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學試劑 補體C3a（北京博奧森公司），TPS（美國DAKO公司），熒光顯色劑，二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑，磷酸鹽緩沖液（PBS），山羊血清封閉液（北京中衫金橋公司）。

1.2.2 方法及結果判定 所有標本均以10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋。連續石蠟切片，厚約4μm。取肺組織切片進行常規HE染色，免疫組織化學標記及熒光標記。標記抗原為補體C3a、TPS。免疫組織化學采用Envision法，DAB顯色。組織抗原修復采用高壓與微波修復處理。補體C3a稀釋濃度為1∶50，TPS稀釋濃度為1∶100。結果判定以肺小動脈或者肺毛細血管內或血管周圍出現棕黃色顆粒為陽性結果。棕黃色顆粒少或顏色淡為弱陽性。

1.3 統計學處理 所得數據采用SPSS13.0統計軟件進行處理，運用四表格法的確切概率（FISH法）計算，以P＜0.05差異有統計學意義。

2 結 果

尸檢明確診斷為AFE的4例病例（AFE組），其HE染色的肺組織切片中，小血管以及毛細血管內看到成團或絲狀的鱗狀上皮（圖1）。

AFE組TPS陽性表達4例，陽性表達為棕黃色顆粒呈光環圍繞肥大細胞周圍，見圖2，陰性對照組肺組織和AFE組中補體C3a表達情況見圖3、4，TPS熒光陽性表達則在肺組織毛細血管內可見綠色熒光斑，見圖5；PHH組TPS陽性表達9例；陰性對照組TPS弱陽性表達1例；AFE組、PHH組與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 AFE病例肺小動脈內羊水有形成分（HE×40）

圖2 肺組織中肥大細胞脫顆粒TPS表達情況（免疫組織化學×400）

圖3 陰性對照組肺組織中補體C3a表達情況（免疫組織化學×100）

圖4 AFE組補體C3a情況（免疫組織化學×100）

AFE組補體C3a表達較對照組均降低，陰性對照組中補體C3a表達情況，可見多量棕黃色顆粒，呈陽性表達（圖3）；圖4AFE組中補體C3a情況，與圖3比較棕黃色顆粒明顯減少，呈弱陽性表達；PHH組部分補體C3a表達較對照組亦降低，弱陽性表達7例；陰性對照組補體C3a8例均陽性表達；AFE組、PHH組與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 肺泡壁毛細血管TPS熒光表達（免疫熒光×200）

3 討 論

AFE雖發生率低但母嬰死亡率高，易引起醫療糾紛需要法醫學鑒定［5］。目前尚無統一、明確的診斷標準，因此不少患者可能被誤診，一些輕癥及不典型患者會因一過性表現而漏診，貽誤最佳治療時機。

傳統診斷無法解釋補體活化及類胰蛋白酶釋放現象［6］，近年研究發現AFE在血流動力學及血液學上與過敏性休克極為相似［7］。多數學者在研究AFE病例時，僅僅評估其類胰蛋白酶水平，從肥大細胞脫顆粒角度探討其與過敏反應的關系，并沒有同時檢測補體水平變化［8］。值得一提的是，在補體參與經典的抗原抗體介導的過敏反應中，可引起肥大細胞脫顆粒反應［9］。補體活化可直接、間接導致機體自身組織損傷，可能是肺循環功能障礙的主要原因，故補體活化可能是AFE的始動環節［8］。本研究中AFE組補體C3a表達與陰性對照組比較，大幅度的降低，而陰性對照組的病例之間的補體水平表達沒有明顯改變，說明了在AFE過程中可能存在補體活化；產后出血病例中，7例補體C3a表達呈弱陽性，說明此部分的產后出血病例中，可能也存在補體活化。目前關于補體在AFE中作用機制的研究尚少，本課題的回顧性研究對補體C3a與AFE的關系不能做最終定論。其在AFE中的確切分子生物學機制仍待進一步的實驗研究。

本研究還發現，AFE病例HE染色均能觀察到羊水有形成分，在支氣管壁、肺泡毛細血管檢測到類胰蛋白酶，呈衛星現象包繞肥大細胞，免疫熒光陽性［10］，表明肥大細胞發生脫顆粒反應，提示在AFE的過程中可能存在過敏反應。本研究16例產后出血（包括2例疑似AFE），類胰蛋白酶陽性表達9例，表明此部分產后出血也可能存在過敏反應。國外報道，超過50%的AFE尸檢病例，并無AFE典型臨床表現［11］，僅為大量產后出血［12］。本研究中的9例產后出血是否與AFE有直接關系，尚不能確定，還有待更進一步的研究。

對AFE患者或是可疑AFE患者可嘗試同時檢測補體C3a、類胰蛋白酶的含量，為臨床早期治療、預防嚴重并發癥、緩解緊張的醫患關系及為法醫學鑒定診斷提供一個較準確的依據，也為AFE的進一步研究奠定基礎。

［1］孫富琴.羊水栓塞診治進展［J］.現代中西醫結合雜志，2008，17（26）：4201－4203.

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［4］Liao WC，Jaw FS.A noninvasive evaluation analysis of amniotic fluid embolism and disseminated intravascular coagulopathy［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2011，24（11）：1411－1415.

［5］Stolk KH，Zwart JJ，Schutte J，et al.Severe maternal morbidity and mortality from amniotic fluid embolism in the Netherlands［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2012，91（8）：991－995.

［6］侯志剛，宋子亨，趙敏，等.羊水栓塞孕鼠血清類胰蛋白酶的變化及意義［J］.遵義醫學院學報，2011，34（4）：407－408，412.

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［11］Stafford I，Sheffield J.Amniotic fluid embolism［J］.Obstet Gynecol Clin N Am，2007，34：545－553.

［12］趙敏，余艦，張國棟.產后出血與羊水栓塞關系的初步研究［J］.中國婦幼保健，2011，26（3）：356－357.