巨細胞病毒感染小鼠結腸中腸三葉因子的表達及更昔洛韋的干預作用＊

劉 芹，王 軍，葉黎離，鄭玉艷，劉文強，楊倩倩

（徐州醫學院附屬醫院，江蘇徐州 221000）

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于皰疹病毒亞科，是導致胃腸道感染的常見病原體［1］。在發展中國家，高達80%的兒童在3歲前就已經感染HCMV。HCMV結腸炎患者的結腸內可見的大面積的潰瘍，患者因久治不愈會造成中毒性結腸擴張、腸穿孔、腸息肉、腸癌、腸狹窄和腸梗阻等，甚至危及生命［2］。CMV具有嚴格的種屬特異性，但鼠巨細胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）和HCMV在基因及核酸水平有很多相似性［3］，為本研究CMV感染機制提供了依據。腸三葉因子（intestinal trefoil factor，ITF／TFF3）屬于三葉因子家族肽［4］，是一類較新的腸黏膜保護因子，在腸黏膜的保護和損傷修復中發揮重要作用。它既能與黏液糖蛋白結合成凝膠，增強黏膜防御功能，又可以促上皮細胞移動，加速損傷修復，保持腸黏膜完整，從而限制了組織流動，電解質丟失，減輕了免疫所致的腸道炎癥反應［5－7］。本文參照文獻［8］建立小鼠CMV感染模型。并在其基礎上研究ITF的表達情況，探討ITF在MCMV感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞培養 小鼠NIH／3T3細胞及MCMV Smith毒株由山東省醫學科學院微生物研究所提供。小鼠NIH／3T3細胞按常規方法培養傳代［8］。MCMV Smith毒株小鼠體內傳毒健康純系BALB／c小鼠（購自徐州醫學院實驗動物中心，飼養在徐州醫學院動物室清潔層柜內），雌性，6～8周齡，體質量18～22g。甲基潑尼松龍注射液每只2mg，每4天肌內注射1次；第1次藥物注射后第2天每只小鼠腹腔接種105.31／mL PFU MCMV Smith病毒懸液；病毒接種后第14天用眼球摘除法處死小鼠取唾液腺；每個唾液腺用無血Dubecco MEM Eagle培養液1mL充分勻漿；離心取上清分裝，置－80℃冰箱保存待用。測定病毒致半數細胞感染量TCID50＝105.31／mL。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型制備及分組 雌性BALB／c，4周齡，體質量8～12g，采用酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒檢測MCMV IgM、IgG，MCMV IgM、IgG均陰性者判斷為無 MCMV感染，納入研究。在12／12h晝夜循環條件下自由進食，實驗前適應1周。實驗動物隨機分為空白組、病毒組和更昔洛韋（ganciclovir，GCV）組，每組8只小鼠，小鼠腹腔接種含病毒105.31／mL的病毒液100μL，建立播散型MCMV感染小鼠模型，自病毒接種后24h為0d，GCV組在接種病毒懸液24h后給予GCV（國藥準字：H111101－1，湖北科益藥業有限公司）50mg／kg腹腔注射每日1次，14d，同時空白組和病毒組在相應時間點分別給予同等劑量的生理鹽水。實驗小鼠分別于第3、7、14天處死后取出肝臟、結腸放于4℃預冷的無RNA酶的凍存管中，液氮保存。

1.2.2 MCMV－DNA PCR檢測 購買天根公司DNA提取試劑盒（目錄號為DP304），提取DNA后于紫外分光光度計下測定A260／A280，穩定1.8～2.0為可用，－20℃保存備用。引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：5′－TCA GCC ATC AAC TCT GCT ACC AAC－3′，下游引物：5′－ATC TGA AAC AGC CGT ATA TCA TCT TG－3′產物長度為100 bp，退火溫度為59℃。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外線燈下觀察有無MCMV－DNA電泳條帶。

1.2.3 總RNA提取 采用異硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取總RNA，于紫外分光光度計下測定A260／A280，穩定于1.8～2.0為可用，－80℃保存備用。引物設計及合成，均由上海生工生物工程有限公司合成。ITF序列如下，正義引物：5′－ACA ACC CTG CTG CTT GGT CCT －3，反義引物：5′－TCT GTC TCT TGC AGA GGT TTG－3′；擴增片段為：212bp，退火溫度為59℃。內參序列鼠甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH），正義引物：5′－CCA AAA GGG TCA TCA TCT CC－3′，反義引物：5′－CAA CCT GGT CCT CAG TGT AGC－3′，擴增片段：498 bp，退火溫度為58℃。實時定量逆轉錄－聚合酶鏈反應（RTPCR）以RT－PCR二步法進行ITF mRNA檢測，PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，采用凝膠成像分析系統（GIS－2008型，上海天能科技有限公司）進行吸光度掃描分析，結果以ITF mRNA擴增條帶與GAPDH內參擴增條帶的掃描峰面積比值表示mRNA的相對含量。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行數據分析，計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），組間兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 生長發育情況 病毒組小鼠出現食欲差、活動少；皮毛稀松、對刺激反應遲鈍、生長遲緩、體質量不增等表現。

2.2 PCR檢測結果 病毒組肝臟、結腸組織 MCMV－DNA PCR電泳可見陽性條帶，空白組無陽性條帶，GCV組亦可見陽性條帶，但和病毒組比較明顯變暗、模糊。見圖1、2。

圖1 肝臟組織MCMV－DNA PCR結果

2.3 各組小鼠結腸黏膜ITF的表達比較 空白組ITF mRNA表達量在3、7和14d時類似；病毒組在3d時增加，14d時達高峰，3個時間點表達量差異有統計學意義（P＜0.05）；GCV組在3d時開始增加，14d時達高峰，3個時間點表達量差異有統計學意義（P＜0.05）。7、14d時，GCV組ITF mRNA表達量高于病毒組和空白組（P＜0.05），3、7、14d時，病毒組高于空白組（P＜0.05）。見圖3、表1。

圖2 結腸組織MCMV－DNA PCR結果

圖3 結腸組織ITF RT－PCR結果

表1 實驗小鼠ITF表達的比較（，n＝8）

表1 實驗小鼠ITF表達的比較（，n＝8）

a：P＜0.05，與病毒組和 GCV組比較；b：P＜0.05，與病毒組比較；c：P＜0.05，與同組7、14d時比較。

組別3d 7d 14d空白組 0.930±0.051a0.950±0.056a1.050±0.072a病毒組 0.970±0.041c 1.120±0.0751.360±0.085 GCV組 1.250±0.110c 1.450±0.120b 1.700±0.140b

3 討 論

巨細胞病毒屬于皰疹病毒家族中的一員，成人的感染率在40%～100%。大部分感染并沒有臨床癥狀出現，通常有終身的潛伏期，但CMV感染能夠引起嚴重的胃腸道疾病。臨床上嚴重的胃腸道CMV疾病通常發生在免疫受損的患者中［9］，在免疫正常人群中感染很少報道。CMV感染可使炎癥性腸病患者病情更加復雜，導致重癥率和死亡率升高［10］。

ITF通過疏水鍵同黏液糖蛋白（mucin，MUC）結合，形成穩定的凝膠復合物，此凝膠復合物可以抵抗胃腸道胃酸、蛋白酶和機械損傷等，從而增強了胃腸道黏膜屏障的防御能力，并能促進上皮細胞向損傷處的遷移［11］。細胞遷移是黏膜受損后早期修復的關鍵過程，損傷區域周邊細胞遷移到損傷部位，重建上皮的完整性和黏膜屏障。Vandenbroucke等［12］在口服硫酸葡聚糖誘導腸道炎癥的實驗中發現，實驗組予胃飼有生物活性的ITF，只發生輕度的上皮損傷；而對照組則死于廣泛性結腸炎，證實了ITF在維持黏膜屏障中的作用。組織學檢查發現ITF基因剔除小鼠沒有早期修復過程，而給予重組ITF后，ITF基因剔除的小鼠能夠恢復正常的黏膜修復功能［13］。大量實驗證明，ITF在胃腸道中的保護和修復過程中發揮重要的作用。

腸道HCMV感染主要出現于免疫功能低下的人群如艾滋病患者、器官移植患者、惡性腫瘤患者及炎癥性腸炎患者等，但CMV感染后能否導致人體免疫功能的進一步損傷尚未得到證實。本研究發現，4周齡小鼠接種MCMV后出現生長發育減緩，體質量減低，與空白組相比，病毒組結腸組織ITF蛋白表達升高。提示MCMV造模后3d，小鼠結腸黏膜可能處于修復早期，ITF的表達有上調的趨勢。與病毒組相比，GCV組結腸組織中ITF表達明顯升高，提示GCV在CMV腸道感染中的治療作用可能是通過上調ITF基因表達，促進受損區域上皮細胞的重建，可能是藥物發揮黏膜修復重建作用的機制之一。

綜上所述，ITF在CMV感染腸道的發生、發展中起著重要作用，這也為CMV的發病機制研究及其臨床治療提供了一個新方向。引用外源性ITF或者提升ITF活性可能成為治療CMV感染的新靶點。

［1］Kim HC，Hwang EA，Park SB，et al.Historical comparison of prophylactic ganciclovir for gastrointestinal cytomegalovirus infection in kidney transplant recipients［J］.Transplant Proc，2012，44（3）：710－712.

［2］Maher MM，Nassar MI.Acute cytomegalovirus infection is a risk factor in refractory and complicated inflammatory bowel disease［J］.Dig Dis Sci，2009，54（11）：2456－2462.

［3］Torres－Madrizg T，Boucher HW.Immunocompromised hosts：perspectives in the treatment and prophylaxis of cytomegalovirus disease in solid－organ transplant recipients［J］.Clin Infect Dis，2008，47（5）：702－711.

［4］Kjellev S.The trefoil factor family－small peptides with multiple functionalities［J］.Cell Mol Life Sci，2009，66（8）：1350－1369.

［5］王煥，吳修文，萬千雪，等.腸三葉因子和黏蛋白對燒傷血清所致腸上皮細胞增殖移行能力變化的影響［J］.中華燒傷雜志，2011，27（5）：347－352.

［6］Neal MD，Richardson WM，Sodhi CP，et al.Intestinal stem cells and their roles during mucosal injury and re－pair［J］.J Surg Res，2010，167（1）：1－8.

［7］Poulsen SS，Kissow H，Hare K，et al.Luminal and parenteral TFF2and TFF3dimer and monomer in two models of experimental colitis in the rat［J］.Regul Pept，2005，126（3）：163－171.

［8］徐翼，方峰，董永綏，等.小鼠巨細胞病毒全身播散型感染模型的建立［J］.臨床兒科雜志，2008，26（6）：517－520.

［9］Onyeagocha C，Hossain MS，Kumar A，et al.Latent cytomegalovirus infection exacerbates experimental colitis［J］.Am J Pathol，2009，175（5）：2034－2042.

［10］Suzuki H，Kato J，Kuriyama M，et al.Specific endoscopic features of ulcerative colitis complicated by cytomegalovirus infection［J］.World J Gastroenterol，2010，16（10）：1245－1251.

［11］Sasaki M，Ikeda H，Nakanuma Y.Expression profiles of MUC mucins and trefoil factor family（TFF）peptides in the intrahepatic biliary system：physiological distribution and pathological significance［J］.Prog Histochem Cytochem，2007，42（2）：61－110.

［12］Vandenbroucke K，Hans W，Van Huysse J，et al.Active delivery of trefoil factors by genetically modified Lactococcus lactis prevents and heals acute colitis in mice［J］.Gastroenterology，2004，127（2）：502－513.

［13］Beck PL，Wong JF，Li Y，et al.Chemotherapy－and radiotherapy－induced intestinal damage is regulated by intestinal trefoil factor［J］.Gastroenterology，2004，126（3）：796－808.